《Bioresource Technology》：Strategic enrichment of ammonia-oxidizing archaea biofilms coupled with process optimization for mitigating N
2O emissions in wastewater treatment system
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stilbenoid生物合成研究通过工程大肠杆菌实现了高效生产，采用CRISPRi动态调控malonyl-CoA分配平衡代谢，结合结构导向计算分析与正交标记系统优化酶共定位和中间体传递，使piceatannol产量达583.10 mg/L，pterostilbene达1110.92 mg/L，并验证了技术经济可行性。
赵国富|李鹏派|丁新耀|吕久功|杨颖|刘琳|子莉涵|张强|梁丽娅|刘荣明
中国大连理工大学生物工程学院生物智能制造重点实验室，大连 116024
摘要
芪类化合物是具有强生物活性的植物来源多酚，这使它们在制药和营养保健品领域具有巨大潜力。然而，由于其在植物中的天然含量较低以及化学合成过程中存在的毒性问题，其生产仍然具有挑战性。在这里，我们开发了一种综合策略，对大肠杆菌（Escherichia coli）进行改造，以实现多种芪类化合物的高效生物合成。我们利用对香豆酸（p-coumaric acid）具有响应性的CRISPRi系统动态调节丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）的分配，从而平衡宿主代谢和芪类化合物的生产。我们系统地探讨了酶共定位策略，并利用基于结构的计算机模拟（in silico）分析来支持双酶融合设计。正交的SpyTag/SpyCatcher和SnoopTag/SnoopCatcher系统实现了最佳的中间产物通道化，显著提高了代谢途径的通量。结果，我们从甘油中合成了最高浓度的白藜芦醇（494.30 mg/L，添加L-酪氨酸后提高到583.10 mg/L）和飞燕草素（563.89 mg/L，添加L-酪氨酸后提高到1110.92 mg/L）。技术经济分析表明，通过优化代谢调控、酶共定位和工艺设计，显著提升了芪类化合物生产的可行性。总体而言，本研究展示了芪类化合物生物合成的潜力，并为其他复杂天然产物的高效合成提供了有价值的范例。
引言
芪类化合物是一类植物来源的多酚类次级代谢产物，具有广泛的药理活性，包括抗癌、抗氧化和抗炎作用（Costa等人，2022；Culp等人，2024；Kuziel等人，2025）。这些生物活性特性在营养保健品和制药行业中引起了广泛关注（Reimer等人，2022；Wang等人，2025；Zhou等人，2025）。然而，芪类化合物的化学合成存在纯化困难、使用有毒试剂、需要苛刻的条件以及较大的环境足迹等问题，这些因素严重限制了其大规模生产（Kumar等人，2021）。此外，芪类化合物在植物中的天然含量极低（例如，白藜芦醇：0.03–15 mg/kg；飞燕草素：0.0441 mg/kg；白藜芦醇：20.8 mg/kg）（Ispiryan等人，2024；Lourencao Zomer等人，2021；Zhang等人，2022），导致生产效率低下且不可持续。通过代谢工程进行微生物合成已成为一种有前景的可持续替代方法。然而，微生物合成的芪类化合物产量仍然较低，且可扩展性有限。
虽然经过改造的大肠杆菌已经能够利用简单的碳源（Heo等人，2017；Hong等人，2020；Li等人，2022；Park等人，2021；Yan等人，2023）或添加的中间产物（如L-酪氨酸、香豆酸、白藜芦醇和丙二酸）来合成芪类化合物（Jeong等人，2014；Shrestha等人，2018；Wu等人，2017；Zhao等人，2018），但前体物质（芳香族氨基酸和丙二酰辅酶A）的供应不足仍然是芪类化合物生产的主要瓶颈。目标产物的合成通常需要从共同的代谢节点转移多个前体；当过多的碳流被用于合成所需化合物时，会引发碳流冲突，干扰正常的细胞过程并降低产物的产量（Park等人，2021；Wang等人，2024a；Yan等人，2023）。因此，要实现高产量的芪类化合物生产，必须建立一种动态机制，以平衡芪类化合物合成和细胞生长所需的碳流。
此外，芪类化合物代谢途径的多酶级联结构带来了严重的代谢负担。这些漫长的合成途径消耗了细胞内的碳流，而酶在细胞内的空间分散加剧了代谢产物的扩散损失；非特异性的酶-酶相互作用产生了不必要的副产物，基因表达失衡导致有毒中间产物的积累。这些因素共同严重降低了最终产品的产量。传统的柔性连接剂（Wang等人，2011）、模块化组装（如SpyTag/SpyCatcher介导的融合Jia等人，2022）以及利用计算机模拟的多酶组装方法（iMARS）设计的人工融合酶（Wang等人，2025）虽然成功提高了香豆酸和白藜芦醇的产量，但它们的效果高度依赖于具体设计。只有某些配置被证明能提高活性（Liu等人，2022），而许多其他配置则破坏了蛋白质的折叠结构或降低了催化效率（Chen等人，2022；Liu等人，2021；Qin等人，2021）。例如，Ding等人在酵母中证明，基于GGGGS的ZL2W连接剂在crtZ和crtW之间显著提高了虾青素的产量，同时减少了玉米黄质和角黄质的副产物生成；而其他配置则导致产量下降和副产物增加（Ding等人，2023）。这些观察结果突显了酶融合设计的敏感性，并强调了需要系统性的途径工程方法来提高酶的兼容性、维持代谢通量的平衡，并支持整个芪类化合物合成途径的高效催化。
为了解决微生物芪类化合物合成中的关键代谢限制，不仅需要克服多酶级联中的局部效率问题，还需要解决关键前体物质的全球竞争问题。虽然酶共定位通过减少中间产物的扩散提高了途径效率，但它本身无法解决前体在生产和细胞生长之间的动态分配问题。在这里，我们建立了一个模块化且综合的代谢工程框架，该框架将前体流量调节与途径结构协调起来，实现代谢资源的有效重新分配，同时最小化中间产物的损失。具体而言，该框架包括增强前体生成代谢、适应性地平衡丙二酰辅酶A的流量以满足生长和生产的需要，以及空间组织途径酶以改善底物通道化和催化效率。这一框架的通用性已在多种芪类化合物产品中得到验证，并通过技术经济分析评估了其工业应用价值。
菌株和质粒
质粒和菌株的详细信息见补充材料。质粒构建是在大肠杆菌DH5α中完成的。引物信息也列在补充材料中。本研究中使用的酶的来源和登录号同样在补充材料中提供。起始菌株为L-苯丙氨酸过表达菌株ES23。ES23（DE3）用于构建质粒的功能表达以及白藜芦醇、白藜芦醇和飞燕草素的生产。
从酪氨酸合成白藜芦醇的代谢途径
为了构建异源白藜芦醇代谢途径，我们将来自Phanerochaete chrysosporium的酪氨酸氨裂解酶（TAL）、来自Arabidopsis thaliana的4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）以及来自Vitis vinifera的突变型芪类合成酶（VvSTS-T50I/V170A）引入ES23菌株，得到了ES23-r1菌株（图1a和b）。经过IPTG优化后（见补充材料），ES23-r1在48小时内积累了68.84 mg/L的白藜芦醇和164.24 mg/L的香豆酸（图1c和d）。
由于每分子香豆酸需要三个丙二酰辅酶A分子
结论
在这项研究中，我们开发了一种综合的代谢工程策略，结合了动态的丙二酰辅酶A调节和正交的酶共定位技术，实现了大肠杆菌中多种芪类化合物的高效生物合成。该方法显著提高了白藜芦醇、白藜芦醇和飞燕草素的产量，其中表现最佳的菌株在补料批次条件下达到了创纪录的产量（白藜芦醇583.10 mg/L，飞燕草素1110.92 mg/L）。
CRediT作者贡献声明
赵国富：撰写原始稿件、方法学设计、实验研究、数据分析、数据管理。李鹏派：撰写原始稿件、验证结果、软件开发。丁新耀：数据管理。吕久功：数据可视化。杨颖：项目监督。刘琳：数据可视化。子莉涵：数据管理。张强：方法学设计。梁丽娅：撰写、审稿与编辑、结果验证、资源协调、项目管理。刘荣明：撰写、审稿与编辑、结果验证、资源协调、项目管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了辽宁省自然科学基金（2025JH2/101330156、2024-MSBA-09、2025-BS-0025）、国家自然科学基金（22278058、22208044、22578048、62503077）、国家重点研发计划（2023YFC3402300）、青年教师科研创新能力支持项目（SRICSPYF-ZY2025107）、“兴辽人才计划”（XLYC2203075）以及大连市科技创新基金的支持。
