具有活性位点丰富的纳米结构，可实现双重增强的电子转移，从而实现对结肠癌中DNA甲基化的超高灵敏度电化学发光检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Active-site rich nanostructure with?dual-enhanced electron transfer?for?ultra-sensitive?electrochemiluminescence detection of DNA Methylation in colon cancer

基于DNA四面体纳米结构探针和双增强电子转移机制，本研究开发了新型电化学发光生物传感器，实现结直肠癌相关Septin9基因甲基化检测限低至8.2 aM。临床样本验证表明其灵敏度和特异性与金标准相当。

　　

肖天|侯玉婷|栾亮|叶凌志|袁俊杰|张雅婷|李明良|曲向萌|南婉

北方战区总医院实验医学中心实验室，中国辽宁省沈阳市沈河区文华路83号，110016

摘要

传统的结肠癌DNA甲基化检测方法在临床样本中仍面临灵敏度不足、特异性有限和成本效益低的问题。本文开发了一种基于双重增强电子转移机制的电化学发光生物传感器，使用DNA四面体纳米结构探针实现对与结肠癌相关的甲基化DNA的超灵敏检测。这种DNA四面体结构探针克服了在复杂临床样本中由于结合效率低和空间位阻大导致的适应性问题。该电化学发光生物传感器使用富含活性位点的TiO₂-Ti₃C₂ MXenes@AgNPs杂化纳米复合材料作为电活性基底。由于TiO₂的本征光电活性以及AgNPs与TiO₂之间的表面等离子体共振（SPR）效应，这些纳米复合材料表现出加速的电子转移并缩短了反应路径。此外，三维（3D）自组装的AuNPs-ABEI纳米发光球通过集中更多的AuNPs来加速电子转移并固定额外的ABEI分子，显著提高了发光强度。双重增强的电子转移策略显著加快了界面电子转移的动力学。金属纳米颗粒（如AgNP、AuNP和TiO₂）在电化学激发下产生SPR诱导的局部电场，这些电场增强了电子转移并放大了电化学发光强度，从而实现了对甲基化Septin9基因的超灵敏检测，检测限低至8.2 aM。使用来自健康对照组（n = 100）和结肠癌患者（n = 100）的临床血清样本进行的验证表明，该生物传感器在灵敏度和特异性方面与金标准方法相当，检测效果与焦磷酸测序相当。

引言

结肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤，在癌症相关死亡率中排名第二，对公共卫生构成了重大挑战（Arnold等人，2017；Keum和Giovannucci，2019；Sung等人，2021）。其发展是一个复杂的多步骤过程，涉及多种遗传和表观遗传变化。早期症状通常不具体，难以与溃疡性结肠炎、便秘或胃肠道出血等良性胃肠道疾病区分开来，常常导致临床误诊和治疗延迟（Dekker等人，2019）。早期结肠癌患者的5年生存率可超过90%，而晚期结肠癌患者的生存率则急剧下降至不到15%（Klein等人，2021；Siegel等人，2025）。常用的结肠癌筛查“金标准”方法是结肠镜检查。然而，结肠镜检查作为一种侵入性程序存在明显局限性：患者依从性仅为约60%，检测成本高，并且依赖于专业的内镜医生资源，这凸显了开发低成本、早期、快速和灵敏的结肠癌筛查方法的迫切需求（Brenner等人，2014）。DNA甲基化是一种表观遗传过程，其中DNA甲基转移酶将甲基（-CH₃）添加到胞嘧啶（C）的第五个碳原子上（Dai等人，2021），这在肿瘤发生中起关键作用，通过沉默多个基因并破坏其功能（Dawson和Kouzarides，2012；Feinberg和Tycko，2004；Kanai，2010；Panagi等人，2019；Sharma等人，2010）。研究表明，基因甲基化水平的变化在结肠癌发展的早期就发生了（Kang等人，2019；Kong等人，2019），使其成为早期癌症筛查的有希望的非侵入性工具。Septin9基因被认为是最具临床价值的过度甲基化生物标志物之一，其异常甲基化与结直肠癌的发生、进展、侵袭、转移、复发和预后密切相关（Nie等人，2023；Okugawa等人，2015；Rahbari等人，2019；Siu等人，2019）。

目前，DNA甲基化分析方法包括亚硫酸盐测序（Frommer等人，1992；Liu等人，2018）、基于限制性酶预处理的DNA甲基化分析技术（Liu等人，2019；Liu等人，2015）、高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）（Du等人，2019；Yuan，2017）等。然而，这些技术在临床应用中存在某些局限性，例如通常需要复杂的仪器、繁琐的预处理步骤以及依赖复杂的标记程序，导致检测时间延长和灵敏度有限，无法满足临床检测对简单性、速度和高灵敏度的要求。为了满足临床对DNA甲基化检测的需求，电化学发光（ECL）生物传感器因其优势（包括接近零的背景信号、宽动态范围和仪器便携性）成为理想的临床DNA甲基化检测平台（Anand和Ziolkowski，2025；Cao等人，2025；Wang等人，2024；Zhang等人，2020）。通过设计级联放大系统，将微弱的初始信号转换为易于检测的强输出信号，将生物事件转化为可量化的物理信号。利用纳米技术、电化学和分子生物学等技术，开发了创新方法，以便在更早的阶段、更低的检测水平以及更隐蔽的环境中检测疾病指标（Nikshoar等人，2017）。为了进一步提高ECL生物传感器的灵敏度和选择性，通常在工作电极上应用纳米材料或简单的化学修饰（Aizitiaili等人，2021；Li等人，2022；Qi等人，2023；Wang等人，2023；Zhijun等人，2020；Zou等人，2024）。银在可见光谱中具有最低的欧姆损耗，能够产生最清晰和最强的局部表面等离子体共振，从而使其制成的传感器具有极高的灵敏度。金表面可以通过金-硫键轻松功能化各种生物分子（例如抗体、DNA探针和酶），这对于构建高选择性的生物传感器至关重要。同时，银在室温下的导电性最高，其次是金。对于需要快速电子转移的电化学传感器，它们是首选材料。单金属如金和银具有高度化学稳定性且易于功能化。它们通常被制成纳米颗粒、纳米线、纳米块或纳米涂层，并应用于生物传感器的电极表面以加速电子转移并提高检测性能。因此，即使是非常低浓度的纳米金和纳米银也能显著提高性能，为传感器提供出色的成本效益。然而，现有的ECL技术在临床应用中仍面临瓶颈：（1）对复杂临床样本、血清中的蛋白质和脂质的适应性差，这些物质会非特异性地吸附探针，降低结合效率（Li等人，2023；Russo等人，2021；Szunerits等人，2023）；在甲基化位点形成的“疏水球”会导致空间位阻并增加背景信号（Yang等人，2025）；（2）材料界面处能量级不匹配导致的电子转移效率限制，包括共反应物的能量级与发光体的能量级不匹配以及电极材料界面不匹配导致电荷重组（Ding等人，2021；Huo等人，2018；Liu等人，2018）。在传统ECL系统（如Ru(bpy)₃²⁺/TPrA）中，共反应物TPrA氧化产生的TPrA•⁺自由基需要与Ru(bpy)3²⁺进行电子转移以形成激发态Ru(bpy)3²⁺*。如果两者的能量级不匹配（例如TPrA•⁺的还原电位不足），电子转移效率将显著降低（Miao等人，2002）。

在这里，我们成功地构建了一种基于DNA四面体纳米结构探针的双重增强电子转移超灵敏电化学发光生物传感器（图1），用于定量检测结肠癌患者血液样本中的Septin9基因甲基化位点。通过与焦磷酸测序（甲基化检测的金标准）的比较分析，验证了该传感器的高灵敏度和特异性。具体来说，我们合成了新型的功能化纳米材料（TiO₂-Ti₃C₂ MXenes@AgNPs），利用其优异的光电性能和有利的能量级对齐显著降低了检测限，加快了电子转移效率。此外，我们设计并构建了三维自组装的AuNPs-ABEI纳米发光球，为传感器信号转换提供了二次信号放大，从而提高了检测效率和灵敏度。这种超灵敏电化学发光生物传感器能够实现结肠癌患者的早期和精确诊断。它可能成为其他表观遗传疾病及相关肿瘤的早期筛查和预后评估的有希望的技术方法。

材料与方法

材料和试剂、设备及其表征、AuNPs的制备以及通过透射电子显微镜（TEM）的表征（图S1）在补充材料中提供。

双重增强电子转移电化学发光生物传感器的原理和检测过程

血液样本易于获取且侵入性小。通过静脉穿刺收集的外周血中肿瘤细胞的甲基化水平分析是结肠癌患者的有效早期筛查方法（图1a）。在这项研究中，我们首次通过原位生长TiO₂纳米线在Ti₃C₂ MXenes纳米片上合成了新型的TiO₂-Ti₃C₂ MXenes@AgNPs纳米复合材料，利用抗原和抗体的特异性结合进行固定

结论

总之，我们成功开发了一种新型层状纳米复合材料TiO₂-Ti₃C₂ MXenes@AgNPs，并建立了一个基于三维自组装AuNPs-ABEI纳米发光球作为催化放大器的双重增强电子转移超灵敏电化学发光（ECL）生物传感平台，用于DNA甲基化分析。通过利用DNA四面体的结构稳定性、抗原-抗体相互作用的特异性以及高亲和力

CRediT作者贡献声明

叶凌志：验证。 栾亮：验证。 肖天：撰写——初稿，验证，研究。 侯玉婷：撰写——初稿，验证，研究。 曲向萌：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，资源，方法学，概念化。 南婉：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，资源，方法学，概念化。 李明良：验证。 袁俊杰：验证。 张雅婷：验证

未引用的参考文献

Liu等人，2018；Liu等人，2018。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了深圳科技计划（JCYJ20241202130033040，KJZD20240903104400002）、广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515030076，2021A1515012333）、养殖生物技术和可持续水产养殖重点实验室、中国科学院（2025BBSA08）以及北方战区总医院独立研究项目（ZZKY2024026）的财政支持。