一种创新的CRISPR/Cas12a策略，采用空间位阻激活剂实现体内H?O?的原位荧光成像

《Biosensors and Bioelectronics》：A turn-on CRISPR/Cas12a strategy featuring a sterically- hindered activator for in situ fluorescence imaging of H 2O 2 in vivo

实时荧光成像检测活体过氧化氢的新策略基于化学门控CRISPR/Cas12a系统，实现高灵敏度（0.64 μM）和快速响应（<90分钟）的H?O?检测，适用于肿瘤微环境和活细胞动态监测。

李志强|张文贤|冯哲|刘正|冯志远|史阳|詹家银|张静静

长春理工大学化学与环境工程学院，中国长春130022

摘要

过氧化氢（H₂O₂）是癌症和炎症等病理过程中氧化应激的关键生物标志物。然而，由于其缺乏敏感、快速且生物正交的成像方法，其在体内的可视化仍然具有挑战性。在这里，我们提出了一种可被H₂O₂激活的CRISPR/Cas12a策略，称为A-BO-CRISPR，用于活体系统的实时荧光成像。该生物传感策略使用了一种4-溴甲基苯基硼酸蒎醇酯封装的DNA激活剂，其与crRNA的结合最初受到空间位阻的阻碍，从而有效抑制了Cas12a的切割活性。当遇到内源性H₂O₂时，硼酸酯被选择性水解，恢复激活剂/crRNA的杂交，并通过Cas12a介导的ssDNA报告基因的切割产生放大的荧光信号。该系统的检测限为0.64 μM，并能在几分钟内作出响应，实现对活细胞和携带肿瘤的小鼠中H₂O₂流动的实时监测。它在复杂的生物环境中表现出高选择性和稳健的稳定性。通过将化学门控机制与基于CRISPR的信号放大相结合，这项工作为探究氧化还原生物学、成像引导的诊断和治疗监测开辟了新的途径。

引言

过氧化氢（H₂O₂）是一种高反应性的氧物种（ROS），被认为是氧化损伤的强诱导剂以及衰老和炎症的介质。[1], [2], [3] 在正常细胞中，H₂O₂的浓度维持在1-700 nM，但在肿瘤中会升高到超过100 μM，使其成为致癌转化的关键生物标志物。[4], [5] 目前的检测方法——比色法、质谱法和电化学法——仅限于裂解物或渗出物的检测。[6], [7], [8] 尽管光学和磁共振成像已应用于活体样本，但这些方法存在对比度低、背景信号高和材料成本高的问题。[9], [10] 一种基于化学修饰的H₂O₂成像生物传感策略，结合了优异的识别能力和出色的信号放大能力以及深组织兼容性，目前仍然难以实现。

最近，来自原核生物的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关（Cas）蛋白系统已被重新用作可编程的分子开关。[11], [12], [13], [14] 其中，Cas12a（Cpf1）因其表现出依赖目标的杂散DNase活性而脱颖而出，这是切割旁观者单链DNA（ssDNA）报告基因的前提条件。这使得无需扩增即可以飞摩尔灵敏度、高选择性和快速响应来靶向非核酸分析物。[15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22] 尽管CRISPR/Cas系统具有巨大潜力，但在体内应用中按需激活CRISPR/Cas12系统仍面临各种干扰。研究人员采用了基于空间位阻的策略来阻断酶活性，这依赖于Cas蛋白或crRNA的空间位阻掩蔽。蛋白质级别的封装需要多步骤的复杂 conjugation，即使CRISPR/Cas系统被激活，也可能牺牲Cas蛋白的折叠和催化效率。[23], [24], [25] 而crRNA级别的阻断主要发生在连接到核糖糖、磷酸或核碱基的2’-OH上，导致Cas12a/crRNA核糖核蛋白（RNP）组装延迟，激活滞后时间长达数十分钟。[26], [27], [28], [29], [30] 然而，捕捉如H₂O₂爆发这样的瞬态氧化还原事件需要在活体系统中使用更小的时间窗口和快速的动力学（图1A）。

为了解决上述问题，我们设计了一种基于预组装RNP的H₂O₂门控CRISPR/Cas12a电路（A-BO-CRISPR）（图1B），无需操纵crRNA或Cas蛋白。通过将4-溴甲基苯基硼酸蒎醇酯（BOBr）连接到激活剂DNA的磷酸硫酯骨架上，可以空间位阻地阻止DNA链与crRNA之间的杂交，从而将Cas12a锁定在“关闭”状态。当遇到升高的H₂O₂水平时，硼酸酯可以被氧化成酚类物质，随后发生自发的快速1,6-消除反应，解除对磷酸硫酯的掩蔽并恢复激活剂的全部功能。[31] 这种化学“解耦剂”将H₂O₂浓度直接转化为Cas12a的切割活性，导致荧光团-淬灭剂标记的ssDNA报告基因迅速非特异性降解，使荧光团在几分钟内发出荧光。整个RNP激活过程在原位进行，具有高时间分辨率和最小的背景噪声，能够实时成像活体小鼠肿瘤微环境（TME）中的内源性H₂O₂水平波动（图1C）。

A-BO-CRISPR系统的制备

首先，在37 °C下将2 μL的Cas12a（10 μM）与1 μL的crRNA（10 μM）和2 μL的Tris缓冲液混合15分钟以形成RNP。接下来，将2 μL的预组装RNP（1 μM）加入20 μL的100 nM激活剂-BO（A-BO，详见支持信息中的C1.1节），然后加入2 μL两端修饰有FAM和BHQ1的ssDNA（FQ-1，10 μM，见表S1）以及20 μL的Tris缓冲液。

使用A-BO-CRISPR检测A549细胞中外源性和内源性H₂O₂

A549细胞被接种在96孔板中并培养至达到70-80%

A-BO-CRISPR的建立

我们首先在四种A-PS变体（A-PS至A-PS-4，见表S1；图S1）上安装了BOBr部分。在H₂O₂的触发下，A-BO有效转化为A-PS（图S2A），从而可以随后与RNP结合（图S2B）。为了验证上述概念，进行了传统的PAGE分析（图S3）。正如预期的那样，所有含有PS的激活剂变体显示出相似的电泳迁移率。与BOBr反应后，四条带都显示出了

结论

总结来说，我们开发了A-BO-CRISPR，这是一种可激活的CRISPR/Cas12a电路，通过特定的化学“关闭-开启”开关实现肿瘤相关H₂O₂的实时成像。该系统具有快速（<90分钟）、灵敏的检测能力，并在复杂的生物环境中表现出稳健的性能。未来，这一策略可以扩展到监测其他氧化应激标志物或治疗反应。未来的工作将集中在提高组织渗透性和探索

CRediT作者贡献声明

冯志远：方法学、研究、数据分析。刘正：可视化、验证、概念化。詹家银：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、研究、概念化。史阳：数据分析、数据管理、概念化。李志强：初稿撰写、验证、方法学、研究、数据分析。冯哲：可视化、软件、资源。张文贤：可视化，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

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致谢

本研究得到了国家自然科学基金（批准号：22274072）、江苏省自然科学基金（批准号：BK20242022）、中央高校基本科研业务费（批准号：2024300408）、生命科学分析化学国家重点实验室（批准号：5431ZZXM2505）以及吉林省教育厅的科学技术研究项目（批准号：JJKH20261164KJ）的支持。