基于β-琼脂酶的铜绿假单胞菌生物传感器用于环境样品中镉的高灵敏检测

《Biosensors and Bioelectronics: X》：Agarase-Based Bacterial Biosensor for Detection of Cadmium in Environmental Samples

本研究针对环境镉污染检测方法成本高、操作复杂等问题，开发了一种基于PcadR启动子和β-琼脂酶报告基因的比色法全细胞生物传感器。研究人员通过构建pUCP-PcadR-dagA工程菌株，实现了10 ppb-500 ppm宽线性范围的镉检测，与ICP-MS结果高度吻合(R2=0.967)。该技术为环境监测提供了低成本、高灵敏的现场检测方案。

　　

在当今工业化快速发展的背景下，重金属污染已成为全球性的环境挑战。其中，镉（Cadmium, Cd）作为一种具有强生物毒性的重金属，可通过食物链在生物体内富集，引发神经血管疾病、心血管功能障碍和神经发育异常等多种健康问题。世界各国对环境中镉含量制定了严格标准：世界卫生组织规定饮用水中镉限值为0.003 mg/L，美国环保署和欧盟标准为0.005 mg/L，而印度中央污染控制委员会要求工业废水中镉浓度不得超过2.0 mg/L。

然而，传统的镉检测方法如原子吸收光谱法（AAS）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）等虽然灵敏度高，但存在仪器昂贵、操作复杂、需要专业技术人员以及难以进行现场快速检测等局限性。这些缺点严重制约了环境镉污染的日常监测和预警能力。因此，开发一种成本低廉、操作简便且灵敏度高的镉检测技术成为环境监测领域的迫切需求。

在这一背景下，Rajkumar Prabhakaran等研究人员在《Biosensors and Bioelectronics: X》上发表了一项创新性研究，他们成功开发了一种基于β-琼脂酶的细菌生物传感器，用于环境样品中镉的高效检测。该研究巧妙地将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的镉响应启动子P_cadR与β-琼脂酶报告基因（dagA）相结合，构建了一种新型比色法光学全细胞细菌生物传感器（Colorimetric-based optical whole-cell bacterial biosensor, CBOWCB）。

研究人员采用的主要技术方法包括：分子克隆技术构建pUCP-P_cadR-dagA重组质粒；细菌转化技术将重组质粒导入铜绿假单胞菌BC15宿主菌；比色法检测基于β-琼脂酶活性的镉响应信号；细胞固定化技术制备可长期保存的生物传感器；以及ICP-MS作为参考方法验证生物传感器性能。研究还分析了来自印度泰米尔纳德邦马杜赖周边10个地点的30个环境水样（每个地点3个独立样品，各进行3次重复测定）。

3. 结果与讨论

识别机制

该镉生物传感器的识别机制基于P_cadR启动子，这是一种镉特异性转录调控元件，与dagA报告基因融合。当Cd²⁺离子结合后，P_cadR被激活，导致下游报告基因的转录诱导。与其他金属响应系统不同，P_cadR对镉具有高度特异性，与锌或铅等其他二价金属的交叉反应性极低。激活后，dagA基因编码的β-琼脂酶水解琼脂产生新琼二糖和L-脱水半乳糖，这些产物在环境或临床样品中不存在，可实现清晰、选择性的比色检测。

3.1. 构建基于gfp的生物传感器-使用P_cadR

研究人员首先开发了GFP（绿色荧光蛋白）为基础的细菌生物传感器。特异性分析显示，该GFP生物传感器在0.01-250 ppm CdCl₂浓度范围内通过荧光定量检测镉。在铜绿假单胞菌宿主中，克隆RGS16和RGS23表现出比大肠杆菌系统显著更高的GFP表达。这些菌株在56.2-562 ppm（0.5-5 mM）CdCl₂浓度范围内呈现线性GFP响应，通过流式细胞术和荧光分析证实。

3.2. 构建基于比色法的全细胞细菌生物传感器使用琼脂酶生物转导子和定性鉴定环境水样中镉的存在

为了构建CBOWCB，研究人员将琼脂酶（dagA）基因整合到先前构建的GFP生物传感器中。使用琼脂酶作为报告基因是一项创新技术，其底物琼脂是实验室中廉价易得的化合物。研究人员将938 bp的β-琼脂酶（dagA）基因融合到P_cadR启动子下游，得到pUCP-P_cadR-dagA39和pUCP-P_cadR-dagA40构建体，并转化到铜绿假单胞菌BC15中（命名为GSR39和GSR40菌株）。定性检测显示，在镉存在下，重组菌表达β-琼脂酶，通过琼脂水解形成的透明圈可用卢戈尔碘溶液可视化检测。

3.3. 使用铜绿假单胞菌镉细菌传感器定量分析环境水样中的镉

为了降低检测系统的复杂性并增强其便携性，研究人员将琼脂酶融合的细菌全细胞固定在琼脂中。优化条件显示，0.25%琼脂浓度和20 μl菌株量为最佳固定化条件。固定化生物传感器Pa-CadBacS-GSR39和GSR40在ppb（R²= 0.94）和ppm（R²= 0.963）范围内均表现出强烈的线性响应。环境水样检测结果显示，生物传感器与ICP-MS测量的镉浓度高度相关（R²= 0.967），Bland-Altman分析证实了两种方法的一致性。

生物安全性评估

研究中使用的铜绿假单胞菌株是非致病性的实验室适应株，毒性低，属于生物安全等级1（BSL-1）。在可现场部署的固定化生物传感器设备中，细胞被封装在琼脂基质内，最大限度地减少了环境释放和暴露风险。

3.4. 全细胞固定化比色生物传感器的优势

与AAS、ICP-MS等传统技术相比，Pa-CadBacS表现出与ICP-MS相当的灵敏度，同时具有成本低、易于储存、不需要复杂的样品处理程序和易燃气体等优势。CBOWCB的其他优点包括检测元件（细菌芯片）的长期储存、快速检测、设计简单以及低至10 ppb的镉检测能力。

4. 结论

本研究成功将铜绿假单胞菌的镉诱导P_cadR启动子工程化到RSG16和RGS23菌株中，其转录活性显著高于大肠杆菌系统。将938 bp β-琼脂酶（dagA）报告基因与P_cadR控制下的连接产生了功能构建体。工程化铜绿假单胞菌BC15菌株实现了10 ppb至500 ppm CdCl₂的宽线性检测范围（五个数量级；R²= 0.9851）。稳定的全细胞生物传感器Pa-CadBacS-GSR39和Pa-CadBacS-GSR40表现出稳健的响应，在环境相关的ppb和ppm范围内OD₅₇₀线性增加。Pa-CadBacS测量的镉浓度与ICP-MS高度相关（R²= 0.967），证实了其准确性。

这项研究开发的P_cadR-dagA基础全细胞生物传感器为环境监测、风险评估和现场测试中的镉检测提供了一个低成本、高灵敏的平台，具有优异的线性度和可靠性。该技术不仅解决了传统检测方法的局限性，还为资源有限地区的环境监测提供了实用解决方案，在环境污染防控和公共健康保护方面具有重要应用价值。

研究的局限性在于结果主要在受控实验室环境中验证，需要进一步测试野外环境影响和长期稳定性（超过30天）。未来工作方向包括通过启动子工程改进多金属检测能力、在各种野外环境中用加标/天然样品进行验证、开发便携式稳定化格式以及获得现场使用的监管批准。