《Biotechnology Advances》：Strategies for controlled assembly of rod-shaped viral particles
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摘要杆状病毒样颗粒（VLPs）因结构可控、生物相容性高等优势，在药物递送和靶向治疗中展现潜力。本文系统综述了通过基因改造 coat 蛋白、核酸修饰（如调控 OAS 序列）及优化溶液离子强度和 pH 等策略，控制 VLP 自组装过程并影响颗粒形态与生物活性的机制，最后总结了技术局限与未来方向。
穆鲁图拉·拉莫汉（Mruthula Rammohan）| 凯文·V·所罗门（Kevin V. Solomon）
特拉华大学化学与生物分子工程系，美国特拉华州纽瓦克市学院街150号，邮编19716
摘要
由于纳米颗粒在尺寸、形状和表面特性方面具有精确的控制能力，它们在医学应用中的使用日益增多。这种精确控制使得纳米颗粒能够安全、精准地输送到特定组织或细胞类型，并与它们进行可控的相互作用，从而最终提升治疗效果。虽然合成纳米颗粒展现出巨大潜力，但它们常常面临毒性、生物相容性和均匀性等方面的挑战。相比之下，天然来源的纳米颗粒具有天然的优势，如生物相容性和单分散性，这些特性有助于缓解上述问题。棒状病毒和类病毒颗粒（VLPs）尤其具有吸引力，因为它们能够定向组装成分层结构，具有均匀的尺寸，并且表面功能化易于实现，同时长宽比也可调节。这些特性有助于控制纳米颗粒在体内的分布和与细胞的相互作用。目前，人们正在努力利用棒状类病毒颗粒开发纳米医学应用，采取了多种策略来调控其组装过程，例如对包膜蛋白进行基因改造、RNA骨架工程改造以及调整溶液条件等。这些方法能够精确调控VLP的形状、长宽比和组成。本文综述了现有的组装策略，并强调了它们对颗粒形态的影响。同时，也讨论了现有策略的局限性以及将这些组装技术应用于纳米医学中的机遇。
引言
纳米颗粒技术正在显著改变现代医学，并迅速成为各种生物医学应用中的关键组成部分。无论是合成还是天然存在的纳米颗粒，现在都被广泛用于药物输送、生物传感和疫苗接种等领域。（Chung等人，2020年；Murthy，2007年；Nikzamir等人，2021年）纳米颗粒能够运输多种类型的物质，包括小分子、肽、核酸和蛋白质，这些特性对于提升生物利用度、实现靶向作用以及改善生物分布至关重要。（Duan和Li，2013年；Sabourian等人，2020年）例如，颗粒的尺寸和形状会影响其在体内的循环时间和分布。（Hoshyar等人，2016年）颗粒大小、表面电荷以及是否存在靶向配体等参数会影响其在体内外细胞内的摄取和代谢过程。（Blanco等人，2015年；Zein等人，2020年）因此，为了达到预期的效果，必须能够对纳米颗粒的特性进行精确调控。虽然合成纳米颗粒在尺寸、形状、表面电荷、疏水性及表面功能方面具有一定的可控性，但由于制造过程中使用了有机溶剂，某些类型的纳米颗粒仍存在毒性问题。（Strachan等人，2020年）此外，合成纳米颗粒在尺寸上存在多分散性，并且功能化过程较为复杂，这给其在医学应用中的尺寸和表面特性控制带来了挑战。最近获得FDA批准的mRNA封装脂质纳米颗粒也存在局限性，例如它们会在肝脏和脾脏中选择性积累，且由于需要冷链储存而限制了其应用范围。（Khalil等人，2020年；Schoenmaker等人，2021年）而基于生物聚合物的纳米颗粒（如蛋白质纳米颗粒）则具有可生物降解性和生物相容性等优势，使其成为基于颗粒的生物技术平台的理想选择。
病毒是一种自组装的蛋白质结构，具有多种独特特性，如可持续的生物生产能力、分层结构和稳定性。（Steinmetz，2019年）病毒天生具有封装和输送基因组DNA和RNA的能力，因此可作为核酸输送平台。从病毒中提取的类病毒颗粒（VLPs）保留了天然病毒的结构特性，但由于缺乏基因组核酸而不具备传染性，从而提高了安全性。（He等人，2022年；Nooraei等人，2021年）这些病毒纳米颗粒能够组装成由数百到数千个衣壳蛋白组成的分层结构。这些结构具有单分散性，可以为与不同小分子和大分子的结合提供多个位点，从而实现药物输送、抗原展示以激发免疫反应以及诊断等用途。（Brune等人，2016年；Yur等人，2023年）
植物病毒在生物医学应用中具有独特优势。首先，植物病毒专门进化为感染植物宿主，对人体无毒；针对植物病毒的二期临床试验已经证实了其生物相容性和安全性，未出现死亡病例，不良反应也很少。（ClinicalTrials.gov，ID：NCT04473690和NCT02992119）（Nikitin等人，2023年；Nikitin等人，2016年；Royal等人，2021年）虽然二十面体病毒和棒状病毒都被研究用于生物医学应用，但它们在颗粒结构和组装方式上的差异导致了不同的功能特性（表1）（Venkataraman和Hefferon，2021年）。特别是棒状病毒，其特性非常适合生物医学应用。这类植物病毒是RNA病毒，其衣壳蛋白能够通过蛋白质-蛋白质和RNA-蛋白质相互作用自组装成圆柱形颗粒。组装过程从RNA 3′端的组装起始序列（OAS）开始，最终在模板5′端结束（图1）。从这些病毒中提取的VLPs在OAS的存在下也会进行RNA导向的组装，从而完全包裹其负载物，而二十面体病毒则具有固定的负载能力。（Karan等人，2024年）这些颗粒的直径在13纳米到20纳米之间，颗粒长度由所包裹的RNA模板长度决定；这一模板有效控制了颗粒在体内的药代动力学和分布。（Shukla等人，2015年）此外，病毒表面暴露的区域（如C末端）提供了展示功能性基团（如肽、蛋白质、聚合物和小分子）的机会，用于靶向和治疗性输送。（Clare等人，2015年；Yu等人，2012年）
尽管烟草花叶病毒（TMV）属于Tobamovirus家族，是研究最广泛的棒状植物病毒，也是本文的主要模型系统，但还有其他几种棒状植物病毒也被发现并用于多种应用。这些病毒包括刚性病毒（如大麦条纹花叶病毒BSMV）和柔性丝状病毒（如马铃薯X病毒PVX和芜菁花叶病毒TuMV）。尽管这些病毒具有相似的螺旋结构和RNA导向的组装机制，但它们在衣壳蛋白组成、颗粒硬度和基因组内容物及稳定性方面存在差异，这些差异影响了它们的组装行为、表面可及性以及功能化和组装控制的策略。（Adams等人，2009年；Clare等人，2015年；Clare和Orlova，2010年；Cuesta等人，2019年；Grinzato等人，2020年）
虽然这些病毒传统上在植物宿主体内繁殖，但如今通过在酵母和细菌中的异源表达技术，已经实现了可扩展和可持续的生物生产。（Kadri等人，2013a；Lee等人，2020年）异源表达还将生产过程与宿主传染性分离，从而实现了灵活的工程改造。这种灵活性有助于对表面进行各种修饰，并对包膜蛋白进行基因改造，以操控其自组装过程。
目前控制棒状VLP自组装的策略可以改变其某些结构特性，如形状、方向、尺寸以及衣壳蛋白的纵向分布（图2）。控制组装和形态的主要参数之一是衣壳蛋白之间的相互作用。通过基因改造可以精细调节这些相互作用，引入促进自组装的力或减少阻碍自组装的力。对RNA骨架的修改也可以影响结构特性，因为组装过程遵循RNA的导向。通过调节溶液的pH值和离子强度可以改变相邻亚基之间的静电相互作用，从而影响组装和解组装。通常，这些策略会结合使用以达到所需的特性。尽管棒状VLP的自组装能力在器件制造、能量储存和传感等领域得到了广泛应用，但在生物医学中对其组装进行控制的例子却很少。（Chu等人，2018年；Culver等人，2015年）
多项综述讨论了棒状植物病毒和VLPs在结构生物学、材料科学和表面功能化方面的应用，其中自组装通常被视为一种有利特性而非设计参数。（Culver等人，2015年；Solovyev和Makarov，2016年；Steele等人，2017年）在本文中，我们探讨了当前和新兴的控制棒状VLP自组装过程的方法，并研究了这些方法如何影响颗粒形态，进而影响生物行为。此外，我们还强调了将这些组装技术应用于生物医学的机遇和挑战。
涂层蛋白的基因改造
对涂层蛋白（CP）进行基因改造是控制棒状VLP组装的常用策略。（Lu等人，1998年；Zhou等人，2013年）通过改变特定氨基酸，研究人员可以有效地调控影响颗粒形成的相互作用。这种方法有多种应用，包括使用染料和配体进行表面功能化以实现颗粒追踪和受体-配体相互作用。（Brown等人，2013年；Vaidya等人，2023年）
核酸修饰
核酸修饰利用棒状VLP的RNA导向组装来调节颗粒长度或长宽比、结构以及沿颗粒轴的衣壳蛋白组成。病毒RNA具有称为组装起始序列（OAS）的二级茎环结构，该结构能够选择性地与衣壳蛋白相互作用，从而启动组装过程。（Butler，1984年；Butler，1999年）OAS还可以在其他RNA序列上启动蛋白质组装，使其成为一种多功能的工具
溶液离子强度和pH值的调节
基于溶液的调节方法可以直观地控制衣壳蛋白的自组装，通常是基因改造的补充或替代方案。棒状病毒的组装和解组装主要由相邻CP亚基之间的静电相互作用以及CP与被包裹RNA之间的相互作用决定。在许多棒状植物病毒中，这些静电相互作用集中在特定的区域（如Caspar区域）
棒状病毒的临床应用：机遇与局限性
控制棒状病毒组装的策略不仅决定了其在体外的形态，还确立了与生物医学应用直接相关的参数（表2）。通过对颗粒长度（长宽比）、表面组成和负载物的控制，可以调节影响生物行为的颗粒特性，从而合理设计棒状病毒作为输送载体。（Geng等人，2007年；Peralta-Cuevas等人，2025年）特别是RNA导向的组装
结论与未来方向
已经采用了多种策略来调控棒状VLP的组装，使其形成从超长棒状到复杂超分子结构等多种形态。这些策略通常侧重于对CP的基因改造和/或基于溶液的调节，以控制CP亚基之间的相互作用，而核酸修饰则影响CP与RNA模板之间的相互作用。每种方法都有其优势和局限性
致谢
本出版物的完成得益于
特拉华州INBRE项目的大力支持，该项目得到了
美国国立卫生研究院（NIGMS，P20 GM103446）和特拉华州政府的资助。本材料基于
美国国家科学基金会的资助（项目编号：2219276）。图2和图3使用BioRender软件制作。Rammohan, M.（2025）
https://BioRender.com/cw6wqiq
