《Brain Research Bulletin》：Integrated transcriptomic analysis reveals mitochondrial dysregulation and macrophage heterogeneity associated with MTHFD2 in glioblastoma
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本研究针对胶质母细胞瘤(GBM)治疗抵抗性强、预后差的临床难题，聚焦线粒体功能障碍在肿瘤进展及免疫调控中的作用。研究人员通过整合转录组数据分析与单细胞测序技术，系统揭示了线粒体相关基因MTHFD2在GBM中的诊断价值，发现其在肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中高表达，并通过功能实验验证了MTHFD2通过调控IL-6、CCL2等因子促进肿瘤恶性进展及免疫微环境重塑的重要机制，为GBM的免疫治疗提供了新靶点。
胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GBM)作为最具侵袭性的原发性脑肿瘤，长期以来困扰着神经外科领域。尽管手术、放疗和化疗等综合治疗手段不断进步，患者的中位生存期仍难以突破两年大关。这种治疗困境的背后，是肿瘤的高度异质性和复杂的免疫微环境相互作用的结果。近年来，越来越多的证据表明，线粒体功能障碍在肿瘤进展中扮演着关键角色，它不仅影响肿瘤细胞的能量代谢，还深度参与免疫调控过程。然而，线粒体基因改变在GBM中的细胞特异性及其对免疫微环境的精确调控机制，仍是未被完全揭示的科学谜题。
在这一背景下，研究人员将目光投向了线粒体相关基因与肿瘤免疫微环境的交叉领域。他们注意到，肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages, TAMs)作为GBM微环境中最丰富的免疫细胞群体，其功能状态直接影响肿瘤的进展和治疗反应。而线粒体作为细胞的能量工厂和信号枢纽，其在巨噬细胞中的功能状态可能决定着这些免疫细胞的命运抉择。为了深入探索这一科学问题，研究团队开展了一项整合多组学数据的系统性研究。
本研究主要采用了以下几个关键技术方法：基于TCGA-GBM和GEO(GSE66354)数据库的转录组数据分析，通过MitoCarta3.0筛选线粒体相关差异表达基因；单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术结合Harmony算法进行批次校正，分析细胞亚群中线粒体基因表达特征；体外功能实验包括siRNA干扰、细胞增殖(MTS法)、克隆形成、Transwell侵袭实验，以及THP-1来源巨噬细胞的迁移实验；此外还通过免疫荧光染色、小鼠移植瘤模型和ELISA等方法进行机制验证。
3.1. 研究流程设计
研究采用系统性的分析策略，整合TCGA-GBM和GSE66354数据库的转录组数据，识别GBM与正常组织间的差异表达基因，并聚焦于线粒体相关基因。通过生存分析确定预后相关的线粒体枢纽基因，结合单细胞测序数据解析这些基因在肿瘤微环境不同细胞类型中的表达特征，最终通过体外实验验证关键基因的功能。
3.2. GBM中差异表达基因的识别
在GSE66354和TCGA-GBM数据集中，GBM组织与正常脑组织之间存在大量差异表达基因。火山图和热图分析显示，这些基因能够清晰区分肿瘤样本和正常样本，表明GBM具有独特的转录组特征。
3.3. DEGs的功能富集分析
功能富集分析揭示，GBM中上调的基因主要富集于细胞外基质成分和抗原呈递等相关通路，而下调基因则主要参与突触和神经元功能相关过程。这一模式在两个数据集中高度一致，提示GBM中存在免疫激活和突触抑制的典型特征。
3.4. GSE66354数据集中DEGs的功能富集分析
与TCGA-GBM数据集结果相互印证，GSE66354数据集中上调基因富集于细胞周期和细胞外基质 remodeling相关通路，而下调基因则与神经信号传导密切相关。
3.5. GSE66354和TCGA-GBM中的GSEA分析
基因集富集分析进一步证实，GBM中显著激活的途径主要涉及细胞周期和免疫相关通路，而抑制的途径则与神经元信号传导相关，强化了GBM的免疫代谢重编程特征。
3.6. 预后相关线粒体DEGs的识别和列线图构建
通过交叉分析鉴定出10个线粒体相关差异表达基因，其中MTHFD2、SLC25A43和SLC25A22在GBM诊断中表现出极高价值，ROC曲线下面积分别为1.000、0.951和0.996，提示这些基因具有优异的诊断潜力。
3.7. GBM scRNA-seq数据的质量控制和批次校正
单细胞数据经过严格的质量控制和Harmony算法批次校正后，成功消除了技术变异，为后续细胞亚群分析提供了可靠基础。
3.8. 高变基因的识别和主成分分析
通过识别2000个高变基因并进行主成分分析，捕获了GBM单细胞数据中的主要生物学变异信号，为细胞聚类奠定了基础。
3.9. 线粒体特征和枢纽基因的单细胞表达分析
单细胞水平分析发现，肿瘤样本中的线粒体基因集评分显著高于正常样本，且在不同细胞簇间呈现异质性分布。枢纽基因BDH1、SLC25A43、SLC25A22和MTHFD2在肿瘤细胞中显著上调。
3.10. 线粒体特征和枢纽基因的细胞类型特异性分布
进一步分析显示，巨噬细胞和单核细胞具有最高的线粒体基因集评分，且枢纽基因主要在这些髓系细胞中富集，表明线粒体重编程在GBM免疫细胞中尤为显著。
3.11. MTHFD2高表达和低表达巨噬细胞亚群的功能特征
MTHFD2高表达巨噬细胞在肿瘤样本中比例显著增加，且富集于免疫相关通路和代谢重编程途径，如TNFA信号、IL-6/JAK/STAT3信号和糖酵解等，表明其具有促肿瘤表型。
3.12. MTHFD2高、低表达巨噬细胞的伪时序轨迹分析
伪时序分析显示，MTHFD2高表达巨噬细胞位于分化轨迹的末端，代表终末分化的代谢活跃亚群，可能与肿瘤进展密切相关。
3.13. MTHFD2促进胶质母细胞瘤细胞增殖并调控巨噬细胞迁移
功能实验证实，MTHFD2在GBM组织和细胞系中高表达，敲低MTHFD2可显著抑制U251细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力。共培养实验表明，MTHFD2敲低可减少M2巨噬细胞的迁移，并降低IL-6和CCL2的表达水平，证明MTHFD2在肿瘤细胞-免疫细胞互作中发挥关键作用。
研究结论与讨论部分强调，MTHFD2介导的线粒体功能障碍在GBM巨噬细胞中扮演着关键角色，不仅影响肿瘤细胞的恶性行为，还通过调控免疫微环境促进肿瘤进展。这一发现为理解GBM的免疫代谢调控机制提供了新视角，确立了MTHFD2作为潜在诊断标志物和治疗靶点的重要价值。特别值得注意的是，MTHFD2高表达巨噬细胞亚群的特征性代谢重编程状态，可能为开发针对肿瘤免疫微环境的精准治疗策略提供新思路。从转化医学角度考虑，针对MTHFD2的小分子抑制剂已有初步研究，未来通过优化其血脑屏障穿透能力，有望成为GBM治疗的新选择。此外，肿瘤治疗电场(Tumor Treating Fields, TTFields)等物理治疗手段与MTHFD2靶向治疗的联合策略，也值得进一步探索。这项研究不仅深化了对GBM免疫代谢微环境的认识，也为开发新型治疗策略奠定了理论基础。
