《Cellular Signalling》：Potential role of splice junctions of α-synuclein isoforms in the activation of T-cells: Implications for Parkinson's disease
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α-突触核蛋白聚集导致多巴胺能神经元丢失是帕金森病（PD）的核心机制，而N/C端表位激活T细胞和单核细胞免疫反应的研究日益受到关注。本研究通过立体定位注射蛋白聚集体（PFFs）发现，WT-syn和112-syn聚集体较其单体更显著损伤SNPc神经元并破坏运动协调性，同时激活PBMCs产生促炎细胞因子。C端表位抗原性分析表明112-syn的抗原性高于WT-syn，提示剪接异构体通过改变N/C端结构可能驱动PD免疫病理。
Shweta Kaul | Aravind Vulli | Shasi V. Kalivendi
应用生物学系，CSIR-印度化学技术研究所，Uppal Road，海得拉巴 500007，印度
摘要
α-突触核蛋白（α-syn）聚集引起的多巴胺能神经元丢失在帕金森病（PD）的发病机制中起着关键作用。虽然神经炎症与多种神经退行性疾病密切相关，但关于α-syn的N端和C端表位诱导活化T细胞/小胶质细胞的最新研究引起了广泛关注。有趣的是，在PD患者中也观察到了具有改变的N端和C端区域的α-syn异构体的差异表达；然而，它们在T细胞活化中的作用尚未明确。因此，我们研究了单体和聚集形式的α-syn异构体对T细胞活化的影响。我们的结果表明，与单体形式相比，野生型（WT-syn）和112-syn的蛋白质片段（PFFs）的立体定向注射显著导致了SNPc多巴胺神经元的丢失和运动协调能力的下降。此外，WT和112-syn的PFFs显著增强了CD4+和CD8+ T细胞的表达。接受PFFs处理的小鼠的外周血单核细胞（PBMCs）在受到WT-syn和112-syn C端区域肽类刺激时表现出增强的细胞因子反应，这表明它们的抗原性顺序为WT-syn > 112-syn。112-syn的这种增强抗原性表明，特别是112-syn异构体可能在PD的免疫激活中起关键作用，突出了剪接位点作为治疗策略的潜在靶点。
引言
帕金森病（PD）是继阿尔茨海默病（AD）之后第二常见的神经退行性疾病，影响着超过1%的60岁以上人群[1]。黑质中多巴胺神经元的丢失以及主要由α-突触核蛋白（α-syn）组成的蛋白质聚集物（路易小体）的积累是PD的特征[2,3]。路易小体在家族性和散发性PD病例中的存在，以及α-syn的遗传突变与PD之间的关联，强烈表明α-syn在疾病发病机制中的关键作用[4]。事实上，α-syn的表达水平与PD的发病率直接相关[5]。
神经炎症是包括PD在内的多种神经退行性疾病的共同特征。在PD中，各种免疫细胞和信号通路的复杂相互作用发生了改变[6]。这一过程中的一个重要因素是外周血单核细胞（PBMCs）的活化[7]。这些外周免疫细胞，如T细胞，可以浸润脑实质并促进神经炎症和神经退行性变[8]。面对错误折叠的蛋白质等病理刺激时，PBMCs会发生形态学变化，并产生促炎细胞因子、趋化因子和活性氧（ROS），从而进入活化状态[9,10]。活化的PBMCs通过释放促炎细胞因子（如白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）来促进多巴胺能神经元的退化，导致氧化应激、线粒体功能受损并促进神经元死亡[7],[11],[12],[13]。此外，活化的PBMCs和小胶质细胞可以吞噬并清除产生多巴胺的神经元，进一步加剧神经退行性变[14]。同时，神经炎症还会加剧线粒体功能障碍，形成一个恶性循环，促进疾病进展[15]。鉴于神经炎症在PD发病机制中的重要作用，针对炎症通路的治疗方法是很有前景的[16]。
尽管多项研究表明铁死亡、大麻素受体2、线粒体、神经炎症等关键通路参与了α-syn聚集引起的毒性[13],[17],[18],[19]，但最近关于N端和C端表位在T细胞和小胶质细胞活化中的作用的研究引起了广泛关注[8]。这一发现表明免疫系统在PD发病机制中可能起重要作用，并为疾病机制提供了新的见解。然而，新的研究还发现了较小的α-syn异构体，这些异构体表现出更高的毒性[20],[21],[22]，但它们的体内生理效应尚未得到充分研究[22]。从结构上看，α-syn具有三个主要的功能亚域：N端（具有膜相互作用域）[23]、易聚集的疏水性非淀粉样成分（NAC）区域，以及含有参与翻译后修饰的主要残基的酸性C端域，该域具有伴侣活性。迄今为止，已鉴定出四种不同的α-syn剪接形式，即126-syn、112-syn、98-syn和最近发现的41-syn[24]，它们具有不同的生物物理特性和聚集倾向[25]。例如，112-syn是一种缺失外显子5的α-syn变体，其C端区域发生了改变，导致其聚集动力学增强和对多巴胺能细胞的毒性增加，并在PD患者中上调[26]。α-syn的聚集对PD的进展至关重要，因为它们直接与更具有神经毒性的原纤维的生成有关[20,27]。这些有毒的原纤维进一步与膜蛋白相互作用，导致孔洞形成和钙调节紊乱[28]，从而引发PD及相关疾病。
基于上述发现，我们之前的研究发现了α-syn的41个氨基酸肽形式以及氧化剂诱导的112-syn的形成，这些可能参与了PD的发病机制。根据最近关于α-syn的N端和C端表位在T细胞活化中的作用的发现，我们假设α-syn的剪接异构体（即41-syn和112-syn）由于具有改变的N端和C端区域，可以激活黑质中的炎症成分，从而促进PD的病理过程。事实上，我们的结果表明112-syn的C端表位在T细胞活化中表现出增强的抗原性，并表明α-syn剪接异构体的差异表达可能参与了PD的发病机制。
材料
N2a细胞CCL-131?细胞系从ATCC购买，Life Technologies Countess? II FL AMQAF1000用于细胞计数。Luria Broth（M1245）、异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）（MB072）、2×-YT肉汤（M1251）、溶菌酶（MB098）、PFA（甲醛）TC703和过氧化氢（PCT1511从Himedia购买。内毒素OUT TM试剂盒和Ni-NTA树脂从GE Healthcare购买，0.45 μm硝酸纤维素膜10484060从Bio-Rad购买。氨苄西林
α-syn异构体蛋白质片段的制备
文献报道表明，α-syn纤维的行为类似于朊病毒，将其注入小鼠大脑可诱导类似PD的病理变化[32,37,38]。此外，在PD病理过程中也观察到了α-syn异构体的差异表达，但它们在T细胞活化中的作用尚不清楚。因此，为了研究α-syn剪接异构体的毒性，我们使用了之前描述的蛋白质聚集模型来模拟帕金森病条件[38],[39]
讨论
尽管PD在200多年前就被发现，但其发病机制仍未完全明了。虽然线粒体和多种细胞过程在PD中受到影响，但神经炎症与包括PD在内的多种神经退行性疾病始终相关[47]。此外，α-syn的基因剂量与PD的发病率之间存在直接相关性，家族性α-syn突变与PD的关联也表明了α-syn在疾病发病机制中的关键作用
本工作得到了印度科学与工程研究委员会（SERB，CRG/2023/000616）的资助，以及印度科学与工业研究委员会（CSIR）的财政支持。
CRediT作者贡献声明
Shweta Kaul：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、软件使用、方法学、研究设计。Aravind Vulli：可视化。Shasi V. Kalivendi：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、监督、方法学、研究设计、资金获取、数据分析、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
感谢印度科学与工程研究委员会（SERB，CRG/2023/000616）和印度科学与工业研究委员会（CSIR）的财政支持。SK感谢印度大学拨款委员会（UGC）提供的研究奖学金。作者还感谢CSIR-印度化学技术研究所（CSIR-IICT）进行的抄袭检查。
