昼夜节律通过肠道菌群-Th17细胞轴调控骨代谢的新机制：骨细胞循环在骨质疏松中的作用

《Current Research in Microbial Sciences》：Circadian rhythms regulate osteoclast recycling through gut microbiota-dependent Th17 cell expansion

本研究针对昼夜节律紊乱导致骨量丢失的机制不明问题，通过建立休息期间限时喂养（TRF）小鼠模型，结合粪菌移植（FMT）和多种分子生物学技术，揭示了肠道菌群依赖的Th17细胞扩增通过RANKL-RANK-OPG信号通路促进骨细胞（osteomorphs）融合为成熟破骨细胞的关键机制。该发现为昼夜节律紊乱相关骨骼疾病提供了新的治疗靶点，论文发表于《Current Research in Microbial Sciences》。

　　

当我们谈论健康生活时，规律的作息和饮食时间常常被提及。现代生活中，轮班工作、跨时区旅行或熬夜等行为越来越普遍，这些活动都会打乱身体内在的昼夜节律。已有临床研究表明，长期上夜班的女性，尤其是绝经后女性，骨折风险显著增加；睡眠时间异常（过短或过长）的男性和女性，患骨质疏松的风险也更高。这些现象提示，昼夜节律的紊乱对骨骼健康有着不容忽视的负面影响。然而，其背后的生物学机制却一直笼罩在迷雾之中。骨骼是一个高度动态的组织，其健康状态依赖于骨形成（由成骨细胞介导）和骨吸收（由破骨细胞介导）之间的精细平衡。破骨细胞是体内唯一能够降解骨基质的细胞，其活性受到多种因素的调控，其中就包括免疫细胞，特别是辅助性T细胞17（Th17细胞）。另一方面，肠道菌群作为人体的“隐形器官”，其组成和功能也呈现出昼夜振荡，并与宿主的昼夜节律系统相互协调。那么，昼夜节律紊乱是否通过影响肠道菌群，进而改变免疫状态，最终破坏骨稳态呢？为了回答这个复杂而有趣的问题，来自上海交通大学医学院附属第六人民医院的研究团队在《Current Research in Microbial Sciences》上发表了一项研究，揭示了昼夜节律、肠道菌群、Th17细胞和一种新发现的破骨细胞前体——骨细胞（osteomorphs）之间的一条全新调控轴。

为了探究这一科学问题，研究人员综合运用了多种关键技术。他们建立了雄性C57BL/6小鼠的休息期间限时喂养（TRF）模型来模拟昼夜节律紊乱，即在小鼠本应休息的白天（光照期，ZT0-ZT8）提供8小时进食窗口。通过微型电子计算机断层扫描（Micro-CT）对股骨和胫骨进行活体骨结构扫描，以精确评估骨量变化。利用16S rRNA基因测序技术分析了小鼠粪便样本中的肠道菌群组成。通过流式细胞术检测了小肠固有层和骨髓中的免疫细胞亚群，特别是Th17细胞（CD4⁺IL-17A⁺）和调节性T细胞（Tregs， CD4⁺FOXP3⁺）。研究还进行了粪菌移植（FMT）实验，将正常喂养（AL）或TRF喂养供体小鼠的粪便微生物群移植给无菌（GF）受体小鼠，以验证肠道菌群的因果作用。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测了血清中的骨形成标志物P1NP和骨吸收标志物CTX-1，以及骨髓中的核因子κB受体活化因子配体（RANKL）水平。采用定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析了骨骼组织和骨髓中与成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、昼夜节律基因以及Th17/Treg细胞相关的基因表达。此外，还通过体外细胞培养实验，研究了RANKL浓度对破骨细胞分化和融合的影响，以及短链脂肪酸丙酸钠对初始CD4⁺T细胞向Th17细胞分化的调节作用。

长期休息期间限时喂养通过增强骨吸收诱导骨丢失

研究人员首先建立了休息期间TRF小鼠模型。经过12周的干预，尽管TRF组小鼠的体重和每周食物摄入量与自由进食（AL）组相比没有显著差异，但其股骨远端松质骨的骨量却出现了明显减少。Micro-CT定量分析显示，TRF组的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨表面积组织体积比（BS/TV）均显著降低，而骨小梁分离度（Tb.Sp）和结构模型指数（SMI）则升高。重要的是，这种骨表型仅出现在雄性小鼠中，而在雌性小鼠中未观察到，表明休息期间TRF对骨骼稳态的影响存在性别特异性。进一步对骨代谢标志物的分析发现，TRF小鼠血清中代表骨形成的P1NP水平仅有轻微下降，而成骨细胞标志基因（Alp, Ocn）的mRNA表达也仅轻微降低。与之形成鲜明对比的是，代表骨吸收的血清CTX-1水平在TRF小鼠中显著升高，同时破骨细胞标志基因（Trap, Nfatc1, Mmp9, Ctsk, Fos）的转录水平在骨组织中大幅上调。这些结果共同表明，长期紊乱的进食节律主要通过增强破骨细胞介导的骨吸收，而非显著抑制成骨细胞功能，来诱导骨丢失。

长期紊乱进食节律在体内重塑肠道菌群

鉴于肠道菌群在骨稳态调节中的关键作用，研究人员通过16S rRNA测序分析了小鼠粪便菌群。虽然两组小鼠的操作分类单元（OTU）数量和α多样性没有显著差异，但在菌群组成上却发生了明显改变。在门水平上，TRF小鼠中与炎症相关的脱铁杆菌门（Deferribacteres）和蓝藻门（Cyanobacteria）的相对丰度增加。在科水平上，TRF小鼠肠道内能够降解复杂多糖并产生短链脂肪酸（SCFAs，尤其是丙酸盐和乙酸盐）的优势共生菌——Muribaculaceae科的丰度显著降低。与此一致的是，TRF小鼠粪便中的丙酸盐浓度显著下降，而乙酸盐水平无变化。在属水平上，艰难梭菌sensu stricto 1（Clostridium sensu stricto 1）和普雷沃氏菌科UCG-001（Prevotellaceae UCG-001）在TRF组中显著富集。这些结果表明，紊乱的进食节律诱导了特定的肠道菌群失调，并减少了SCFAs（特别是丙酸盐）的产生。

菌群依赖的Th17/Treg失衡促进骨丢失

免疫系统是肠道-骨骼轴的核心环节。流式细胞术分析显示，在TRF小鼠小肠固有层的多种免疫细胞中，只有CD4⁺T细胞的比例显著增加。进一步分析发现，与AL对照组相比，TRF小鼠小肠中的Th17细胞（CD4⁺IL-17A⁺）频率和Il17a基因转录水平均显著升高，而具有抗炎功能的Treg细胞（CD4⁺FOXP3⁺）频率及其相关细胞因子Tgfb和Il10的表达则降低。同样，在骨髓中也观察到了类似的Th17细胞扩增和Treg细胞减少的趋势，表明紊乱进食节律打破了肠道和骨髓中的Th17/Treg平衡。相关性分析进一步发现，Muribaculaceae科的相对丰度与骨量呈正相关，而与破骨细胞标志物和Th17细胞频率呈负相关。更重要的是，使用万古霉素清除肠道菌群后，TRF所诱导的小肠和骨髓中Il17a mRNA表达的升高被完全消除。这证明肠道菌群的存在是紊乱进食节律驱动Th17细胞扩增所必需的。

紊乱进食节律供体粪菌移植诱导骨丢失

为了直接验证肠道菌群的因果作用，研究人员将AL或TRF供体小鼠的粪便菌群移植给持续自由进食的无菌受体小鼠。结果发现，尽管受体小鼠自由进食，但接受TRF菌群移植的小鼠仍然出现了显著的骨丢失，而接受AL菌群的小鼠则没有。同时，TRF菌群移植显著提高了受体小鼠小肠和骨髓中的Th17细胞频率和Il17a mRNA水平。此外，TRF菌群移植小鼠粪便中的丙酸盐浓度也低于AL菌群移植组。体外实验进一步证实，丙酸盐处理能够显著抑制初始CD4⁺T细胞在Th17极化条件下向IL-17A⁺CD4⁺T细胞的分化。这些结果强有力地表明，紊乱进食节律通过改变肠道菌群（如减少丙酸盐产生菌），削弱了对Th17分化的抑制作用，从而导致Th17细胞扩增，进而引发骨丢失。

紊乱进食节律诱导的昼夜节律失调通过RANKL信号通路促进破骨细胞融合

破骨细胞的活化和功能主要受RANKL-RANK-OPG信号通路调控。组织学分析显示，TRF菌群移植小鼠股骨中的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性细胞数量显著增加，血清CTX-1水平也升高。ELISA和qRT-PCR分析表明，TRF菌群移植小鼠骨髓中的RANKL水平以及RANKL/OPG比值显著升高，提示该信号通路被激活。有趣的是，体外实验发现，提高RANKL浓度并未增加破骨细胞的数量，但促进了更大的多核破骨细胞的形成。近年来研究发现，成熟破骨细胞可以分裂成称为“骨细胞”（osteomorphs）的小型可循环子细胞，后者能够在RANKL刺激下重新融合形成功能性的破骨细胞。qRT-PCR分析显示，与AL组相比，TRF小鼠骨髓中骨细胞标志基因（Bpgm和Fbxo7）的mRNA水平降低。同样，在TRF菌群移植小鼠中，经典破骨细胞基因（Acp5, Ctsk）的转录水平上调，而骨细胞标志基因Fbxo7的表达下降。这些发现提示，紊乱进食节律引起的昼夜节律失调，通过激活RANKL信号，促进了骨细胞向成熟破骨细胞的融合，同时抑制了其分裂，从而增强了骨吸收活性。

本研究的重要结论在于，它揭示了一条全新的“肠道菌群-Th17细胞-骨细胞”轴，是介导昼夜节律紊乱诱导骨丢失的关键机制。长期在休息期间进行限时喂养会破坏昼夜节律，导致肠道菌群失调，特别是减少了能够产生丙酸盐的Muribaculaceae等有益菌群。丙酸盐的减少削弱了对Th17细胞分化的抑制作用，导致Th17细胞在肠道和骨髓中扩增，打破了与Treg细胞之间的平衡。增多的Th17细胞通过其分泌的IL-17等细胞因子，上调骨微环境中的RANKL表达，进而激活RANKL-RANK-OPG信号通路。该通路的激活不仅直接刺激破骨细胞生成，更重要的在于促进了新发现的破骨细胞前体——骨细胞（osteomorphs）的融合过程，使其更多地转化为具有骨吸收活性的成熟破骨细胞，最终导致骨量丢失。这项研究的意义非常重大，它将昼夜节律生物学、微生物组学、免疫学和骨代谢研究紧密地联系在一起，为理解轮班工作、睡眠障碍等现代生活方式相关骨骼疾病的发病机制提供了全新的视角。所发现的“肠道菌群-Th17细胞-骨细胞”轴不仅深化了对骨稳态复杂调控网络的认识，也为开发针对昼夜节律紊乱性骨质疏松的微生态干预、免疫调节或靶向骨细胞循环的新策略奠定了重要的理论基础。