《Developmental Biology》：Gene expression cartography of a developing neuronal structure
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本研究针对单细胞测序缺乏空间信息的瓶颈，利用Novosparc算法首次重构了果蝇幼虫视叶的三维基因表达图谱。通过整合发育谱系知识、43个空间标志基因及单细胞转录组数据，成功预测了神经元类型特异性转录因子的时空表达模式，揭示了终端选择子（terminal selector）受时空转录因子层级调控的规律。该工作为复杂脑结构的基因表达重构提供了可推广的计算框架，对理解发育 lineage 如何塑造神经系统空间组织具有重要启示。
大脑是如何在发育过程中将成千上万种不同类型的神经元精确地组装成功能性的神经环路？这一过程需要神经元在正确的时空位置表达特定的基因组合。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术能够高通量地解析细胞类型的转录组特征，但其所提供的空间信息却十分有限。尤其在果蝇（Drosophila）视叶这类结构复杂、发育谱系清晰的模型中，理解基因表达的空间模式对于揭示神经元命运决定和环路组装的机制至关重要。
为了弥补这一技术鸿沟，研究人员开展了一项名为“基因表达图谱技术应用于发育中神经元结构”的研究。他们以黑腹果蝇第三龄幼虫的视叶为模型，利用一种名为Novosparc的基因表达图谱算法，成功重构了该脑区的三维基因表达图谱。这项研究不仅生成了一个可交互的在线三维图谱资源，更重要的是，它揭示了神经元终端选择子（terminal selector）的表达受到时空转录因子（如Hth, D, Erm等）的精细调控，从而阐明了发育 lineage 在塑造大脑空间组织中的核心作用。该成果为在更多复杂脑结构中应用类似的计算重构方法铺平了道路，显著增强了对具有不同发育谱系的神经元如何整合形成功能性大脑的理解。本研究发表于《Developmental Biology》。
为开展此项研究，作者主要运用了以下几项关键技术：1) 基于Blender软件构建了包含245个注释区域的视叶三维空间参考框架；2) 利用已发表的单细胞mRNA测序数据集进行细胞类型鉴定和基因表达分析；3) 采用Novosparc算法，以43个空间标志基因为引导，将单细胞转录组数据映射到三维空间框架中；4) 通过免疫荧光染色、Gal4系表达谱分析和杂交链式反应荧光原位杂交（HCR-FISH）对算法重建结果进行实验验证；5) 开发了交互式网站以实现三维图谱的可视化与数据探索。
结果
三维结构的区域化
研究人员首先根据已知的发育谱系知识，将视叶三维模型划分为12个主要区域，并进一步细分为245个子区域，包括外增殖中心（OPC）的6个空间域和10个时间窗（TW1-10）等。该模型包含41,287个顶点，与单细胞数据集规模匹配，为空间重建提供了精确的解剖学框架。
选择适当的标志基因和参数
研究筛选了43个具有空间信息的标志基因，包括区分细胞类别（如神经上皮、神经母细胞）、神经纤维网（如视叶板、层板）以及空间（如Vsx1, Optix, Rx）和时间（如Hth, D, Erm）转录因子的基因。通过参数优化，最终确定使用alpha=0.5, 基因数=5000等参数进行Novosparc重建。
Novosparc运行评估
重建的基因表达模式与抗体染色结果高度一致。例如，Dpn在神经上皮和神经母细胞中表达，Ase在神经母细胞和GMCs中表达，而Hth和D等时间转录因子在特定时间窗的神经母细胞和神经元中表达。对31个标志基因的评估显示，除Repo（胶质细胞标记）外，重建准确率均很高。定量分析显示，标志基因重建的精确度和召回率均超过95%。
非参考基因表达的重建
研究进一步验证了Novosparc预测非参考基因（如细胞表面分子DIP-β, DIP-ε, DIP-η, DIP-θ和信号分子Wnt2）表达的能力。结果显示，除DIP-θ外，其余4个基因的重建表达模式与Gal4系表达谱高度吻合，表明算法具有良好的预测性能。对非标志基因的定量评估显示精确度约80%，召回率约65%。
Novosparc预测终端选择子的复杂调控
利用三维图谱，研究人员分析了95个候选终端选择子的表达模式，发现约三分之一（31个）形成同心圆环表达，表明其受时间转录因子调控；18个呈现特定的时空模式，提示受时空因子共同调控。通过分析基因表达在前后轴上的分布，可以预测神经元来源于早期、中期或晚期时间窗，例如Bsh、Tsh为早期标记，Vvl、Dve为中期标记，Hbn、Ab为晚期标记。该分析为研究神经元类型特异性特征的调控机制提供了重要线索。
用于探索三维图谱的专用网页
为促进该资源的广泛应用，研究团队创建了一个专用网站（
https://larva3dnovosparc.ijm.fr），用户可交互式可视化多达3个基因的表达，调整阈值，进行虚拟切片，并下载过滤后的数据。
结论与讨论
本研究成功建立了一个重构发育中神经元结构三维基因表达图谱的流程。研究强调，在进行复杂神经元结构的空间重建时，必须充分考虑不同神经元类型的发育起源。尽管Novosparc算法依赖于先验知识且无法捕捉神经元内mRNA的亚细胞定位等局限性，但其仅用43个标志基因便能准确重建复杂结构的能力令人印象深刻。
该三维图谱为产生新的生物学见解提供了框架：首先，它能够预测神经元基因的时空调控规律；其次，可指导针对特定脑区功能实验的候选因子筛选；最后，支持跨物种比较研究，揭示神经系统发育程序的进化。特别重要的是，研究证实终端选择子的表达与时间转录因子动态密切相关，大量候选终端选择子呈现同心圆表达模式，凸显了时间转录因子在协调神经元多样性中的核心作用。
总之，这项工作不仅为研究发育中神经系统的基因调控提供了强大工具，也为在更复杂的大脑中应用类似方法奠定了基础，将显著推动我们对具有不同发育谱系的神经元如何整合形成功能性大脑的理解。
