《Food and Bioproducts Processing》：Semi-synthesis of sodium copper chlorophyllin from
Chlorella vulgaris cultivated under continuous photoperiod and sequential extraction of fatty acids and exopolysaccharides
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通过优化光照周期（12小时和24小时）培养微藻Chlorella vulgaris，成功半合成制备铜叶绿素素（SCC），产量分别为310 mg/g和300 mg/g。光谱分析与商业产品一致，主要成分为Cu-chlorin p6、Cu-rhodin g7和Cu-chlorin e6。脂质含量分别为10.54%和12.02%，经皂化后脂肪酸组成变化显著。同时获得高附加值的外源多糖。研究验证延长光照可提高生物量积累，但12小时周期下SCC产量更高，且通过分步提取实现多目标产物协同获取。
Jamila Sueira de Jesus Silva | Fábio Alexandre Chinalia | Carolina Oliveira de Souza | Denilson de Jesus Assis | Jania Betania Alves da Silva | Gabriele Marques dos Santos | Fernanda Teixeira Cruz | Ravena Maria de Almeida Medeiros | Paulo Vitor Fran?a Lemos | Lucas Guimar?es Cardoso
巴西巴伊亚联邦大学健康科学研究所，校长Miguel Calmon，Canela，Salvador，巴伊亚州
摘要
本研究旨在在12小时和24小时的光照周期下，从Chlorella vulgaris的生物量中制备并表征钠铜叶绿素（SCC），并分析所得生物量中的脂质、脂肪酸和色素的组成。在12小时光照周期（FT12）下，SCC的产量为310 mg/g；在24小时光照周期（FT24）下，产量为300 mg/g。所制备的SCC表现出与商业SCC相当的吸收光谱特征、官能团和主要衍生物。LC-MS鉴定出主要的SCC衍生物包括Cu-叶绿素p6、Cu-罗丹宁g7和Cu-叶绿素e6。通过省略过夜步骤，可以改进SCC的半合成过程，从而缩短生产时间。连续提取法分别获得了10.54%（FT12）和12.02%的脂质，皂化前主要脂肪酸为C18:1和C16:0，皂化后主要为C16:0和C18:3n3。此外，还获得了细胞外聚合物物质（EPS）。该生物工艺不仅实现了SCC的半合成，还回收了高附加值的生物产物。
引言
微藻因其快速生长、高光合效率以及对多种环境条件的显著适应性，成为高价值生物产物的有希望的来源。在调节其生产力的因素中，光照周期起着决定性作用，它影响细胞生化组成以及色素、脂质、脂肪酸和多糖等代谢物的积累。除了其生化多样性外，微藻系统还符合当代生物经济和可持续性原则，因为像Chlorella这样的物种可以在占用少量土地和淡水的情况下进行培养，同时实现高价值色素的低影响生产（Singh等人，2020；Zheng等人，2024）。因此，通过操控培养参数，特别是光照强度和持续时间，是优化生物量生产和实现不同生物产物连续提取的关键策略，从而加强生物精炼技术。
在微藻色素中，叶绿素具有重要的工业和科学价值。然而，由于其内在的不稳定性——对酸性pH值、温度、光照、氧气和酶降解的敏感性，加上水溶性差和消化率低，限制了其直接应用（Singh等人，2020）。作为替代方案，人们开发了半合成衍生物以提高稳定性、溶解性和生物活性，其中钠铜叶绿素（SCC）是最具代表性和商业价值的化合物（Deb等人，2019；Norman等人，2016）。
SCC是通过用Cu2?替换叶绿素四吡咯核中的Mg2?并去除植醇侧链制备得到的水溶性衍生物，具有更高的分子稳定性（Geri?等人，2019）。最终混合物包含多种化合物，其中Cu-叶绿素e6和Cu-叶绿素e4是主要成分（Mortensen，Geppel，2007）。SCC有多种应用，最著名的是作为食品着色剂，同时还具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗病毒、抗癌、抗突变和化学保护作用（Banu和Pavithra，2015；Chen等人，2020；Deb等人，2019；Lin等人，2014）。自1969年以来，FAO（联合国粮食及农业组织）和WHO（世界卫生组织）对其毒性进行了评估，目前SCC已在包括美国、中国、日本和欧盟在内的多个国家获得使用批准，国际监管机构也规定了可接受的每日摄入量（Chong等人，2019）。
尽管SCC的市场价值很高（约307.7美元/克），但其生产仍主要依赖于高等植物，而利用微藻进行半合成的研究相对较少（Singh等人，2020）。其中，Singh等人（2020）报道了从Chlorella minutissima中制备SCC的方法。与高等植物不同，微藻可以在可控的光生物反应器或开放池塘中全年培养，无需争夺耕地或淡水资源，从而确保更高的可持续性和生产力。此外，微藻生物量每单位面积产生的色素量更高，因为微藻通常将其干重的0.5-1.5%用于叶绿素合成，叶绿素a的浓度可达10-18 mg/g干重，而陆地植物的总叶绿素含量通常在0.081-1.112 mg/g鲜重之间，某些物种的最大值接近5-8 mg/g干重（Sijil等人，2022；Aizpuru和González-Sánchez，2024；Coronado-Reyes，2022；Grácio等人，2024；Arshad等人，2023；Li等人，2018；Zielewicz等人，2020）。该过程还会产生富含脂质、脂肪酸和胞外多糖的残余物，这些物质可以进一步回收利用。在这方面，Chlorella物种因其快速生长、高效的CO?吸收、高色素含量以及在食品配方中的广泛应用而特别值得关注（Zheng等人，2024）。
鉴于上述情况，本研究旨在从在12小时和24小时光照周期下培养的Chlorella vulgaris生物量中半合成、优化并表征钠铜叶绿素（SCC）。此外，还探讨了半合成过程对脂质组成、脂肪酸谱和色素含量的潜在影响，以及胞外多糖的提取，从而强调了基于连续提取的方法的相关性，并利用残余生物量生成多种高价值化合物。
本研究中使用的C. vulgaris菌株来自巴伊亚联邦大学（UFBA）生物勘探与生物技术实验室的Iracema Nascimento微藻库。按照Rippka等人（1979）的描述，接种物在含有NaHCO?、K?PO?·3H?O、NaNO?、Na?CO?、MgSO?·7H?O、CaCl?·2H?O、NH?Fe(C?H?O?)?、C?H?O?和EDTA的BG-11合成培养基中培养，并添加了微量元素。使用前对培养基进行了高压灭菌。培养过程在...
图2显示了Chlorella vulgaris在两种光照周期下的生长曲线。在18天的培养期内，FT24处理组的生物量浓度（1.68 g/L）高于FT12处理组（1.17 g/L）。
FT24下生物量增加可以归因于更长的光照时间，在最佳光照强度条件下，光照时间延长促进了细胞生长。然而，超过光照饱和点后，光氧化作用会抑制生长。
24小时的光照周期增加了Chlorella vulgaris的生物量积累，但并未提高叶绿素含量或SCC产量相对于12小时光照周期。光谱分析（UV–Vis、FTIR和LC–MS）证实，提取的SCC具有与商业产品相当的特性。虽然两种光照周期都产生了叶绿素衍生物，但12小时光照周期下的Q带特征更明显，关键SCC成分的相对丰度也更高。
(Aizpuru和González-Sánchez，2024；Borges和Díaz，2012；Coronado-Reyes等人，2020；Eloka-Eboka和Inambao，2017；Ferruzzi等人，2002；Grácio等人，2024；Liu等人，2024；Morais和Costa，2008；Roca和Pérez-Gálvez，2024；Sirisuk等人，2018)
Fernanda Teixeira Cruz： 形式分析。
Gabriele Marques dos Santos： 写作——初稿，形式分析。
Ravena Maria de Almeida Medeiros： 写作——初稿，形式分析。
Carolina Oliveira de Souza： 监督，资源管理，项目协调，资金筹集。
Fábio Alexandre Chinalia： 监督，项目协调，概念设计。
Jania Betania Alves da Silva： 写作——初稿，形式分析。
Denilson de Jesus Assis： 写作——初稿，形式分析。
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
本工作得到了巴西国家科学技术发展委员会（CNPq - 309955/2022-0和INCT MIDAS CNPq - 465594/2014-0）以及巴西高等教育部人员培训协调委员会（CAPES PDPG - 88881.708195/2022-01及财务代码001和88887.667047/2022-00）和Instituto ?nima的支持。
