针对噻虫嗪（thiamethoxam）制备特异性且灵敏的单克隆抗体，并开发用于检测湖水、蔬菜及动物源性食品中噻虫嗪的免疫测定方法

《Food Bioscience》：Preparation of specific and sensitive monoclonal antibodies for thiamethoxam and development of immunoassay methods for detecting thiamethoxam in lake water, vegetables, and animal-derived foods

基于TMX合成二种人工抗原并制备高灵敏度单克隆抗体，建立了ic-ELISA（IC50为0.85 μg/L）和GICA（VLOD为5-10 μg/kg）双检测体系，优化了多组分样本同步提取方法，检测限达0.099-0.117 μg/kg（湖水和蔬菜类）和0.143-0.194 μg/kg（肉类及蛋类），回收率81.5%-121.3%，实现现场快速筛查。

Jiacan Wang|Yiting Wang|Shixiang Wu|Linwei Zhang|Hao Wen|Hongfei Yang|Xu Wang|Dapeng Peng

浙江省动物生物制品工程研究中心，浙江大学兽医科学中心，中国杭州310058

摘要

噻虫嗪（TMX）是一种广泛使用的第二代新烟碱类杀虫剂。然而，不正确的使用方式可能导致残留物在可食用产品中积累，从而对消费者构成风险。因此，准确识别食品中的TMX残留物至关重要。在这项研究中，我们开发了一种能够特异性识别TMX的单克隆抗体（mAb）。为了提高检测灵敏度，采用了异源包被策略进行TMX检测。基于所开发的单克隆抗体，建立了ic-ELISA和GICA方法。使用确定的最佳条件进行ic-ELISA测试时，IC₅₀值为0.85 μg/L。此外，还开发了一种样品提取方法，可以同时处理蔬菜和动物源性食品。在湖水、猪肉、牛肉、鸡蛋和菠菜中的检测限（LODs）为0.099-0.117 μg/kg，定量限（LOQs）为0.143-0.194 μg/kg，回收率分别为81.5%-121.3%。我们还优化了GICA的关键参数：鸡蛋的VLOD为10 μg/kg，而菠菜、牛肉和猪肉的VLOD为5 μg/kg。这两种检测方法能够在现场快速检测中更灵敏、更准确地检测各种样品中的TMX。

引言

噻虫嗪（TMX）是一种新烟碱类杀虫剂，由于其广谱杀虫效果和对哺乳动物的低毒性，被全球用于控制蔬菜和水果种植中的蚜虫、白粉虱和鳞翅目害虫（Zhang等人，2023年）。然而，不当或过量使用可能对非目标生物（如蜜蜂）和人类健康产生严重影响（Liu等人，2020年；Motta等人，2024年）。这些不合理的农药使用会在人们日常食用的农产品（如蔬菜、水果和动物源性食品）中积累（Claeys等人，2011年；Golowczyc & Gomez-Zavaglia，2024年）。长期摄入含有TMX残留物的食物可能对人类健康产生负面影响，如内分泌紊乱和氧化应激（Caron-Beaudoin等人，2017年；Jameel等人，2020年）。鉴于对环境和人类健康的多种风险，欧盟已经制定了使用指南，许多国家也制定了食品中的最大残留限量（MRLs）。2013年，欧盟严格限制了三种杀虫剂（噻虫胺、吡虫啉和噻虫嗪）在户外的使用；2019年，这些杀虫剂的使用被完全禁止（欧盟，2013年、2018a年、2018b年、2018c年）。中国也为各种食品制定了TMX的MRLs，其中动物源性食品的最低限量为10 μg/kg，包括哺乳动物内脏、禽肉及内脏和鸡蛋（中国，2021年）。因此，必须开发高灵敏度的分析方法来保障人类健康。

目前，检测TMX的传统方法主要依赖于仪器分析技术，如高效液相色谱（HPLC）（Jyot & Singh，2017年）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）（Gui等人，2019年；Wang等人，2023年；Xi等人，2024年）。这些方法具有高准确性和高灵敏度的优势，但同时也存在对操作人员技术要求高、需要相应实验仪器和成本较高的缺点。因此，它们仅适用于实验室环境中的检测。基于抗原-抗体识别机制的免疫测定方法，如胶体金免疫层析法（GICA）和间接竞争性酶联免疫吸附测定法（ic-ELISA），相比传统仪器分析方法具有多个优势，包括检测速度快、性价比高、便携性强以及对专业技术知识要求低。因此，它们适用于大规模、快速的现场筛查应用（Li等人，2021年；Tao等人，2014年）。相关研究报道了基于TMX特异性抗体的ELISA和GICA检测方法的开发。例如，Kim等人开发了一种基于多克隆抗体的ELISA方法，用于检测溪水和自来水中的TMX，IC₅₀值为9.0 μg/L（Kim等人，2003年）。Ye等人基于单克隆抗体建立了用于检测黄瓜中TMX的ELISA和GICA方法，IC₅₀值为0.87 μg/L（Ye等人，2018年）。尽管取得了这些进展，但大多数报道的TMX免疫测定方法仅针对单一类别的样本，无法满足对包括蔬菜和动物源性样本在内的多种食品样本进行快速、统一检测的需求。考虑到动物源性食品使用量的增加，以及中国为这些食品制定了10 μg/kg的TMX MRLs（Han等人，2025年），开发用于检测动物源性食品中TMX的免疫学方法至关重要。

在这项研究中，我们制备了具有显著TMX灵敏度和特异性的高性能mAb。基于这种mAb，我们开发了ic-ELISA和GICA，并对其从关键检测参数到样品制备程序进行了系统优化，以获得最佳检测性能。这些技术能够快速、灵敏地检测TMX，满足可靠的现场筛查需求。它们已在多种样本中得到验证，包括湖水、猪肉、牛肉、菠菜和鸡蛋。

材料

本研究使用的所有试剂和材料均列在补充材料中，所有涉及动物的程序均获得了华中农业大学动物伦理委员会的预先批准。伦理批准编号为HZAUMO-2025-0499。

半抗原和完整抗原的合成与表征

在这项研究中，合成了两种半抗原——分别称为半抗原1和半抗原2，它们的合成途径如图1所示。

半抗原的鉴定

在设计半抗原时，需要确保它们在物理和化学结构上与母体分子保持最大程度的相似性。在噻唑环上替换氯原子不仅最大限度地提高了与母体分子的相似性，还充分暴露了TMX的特征结构，从而确保了mAb制备的高特异性（Kim等人，2003年）。因此，我们选择替换噻唑环上的氯原子来获得半抗原。

结论

在这项研究中，合成了两种半抗原，用于生成TMX/1D9杂交瘤细胞系及其相应的mAb。在优化条件下，所开发的ic-ELISA的IC₅₀值为0.85 μg/L。此外，还建立了一种通用的样品提取方法，可以同时处理多种样本（蔬菜、肉类和鸡蛋），操作简便。同时，还开发了一种GICA方法，将检测时间缩短至5分钟。总体而言，这些方法表现出明显的优势。

CRediT作者贡献声明

Linwei Zhang：验证、数据分析。Hao Wen：验证、数据分析。Hongfei Yang：验证、数据分析。Xu Wang：项目管理、数据分析。Jiacan Wang：撰写初稿、验证、研究、数据管理、概念构思。Yiting Wang：验证、研究、数据管理。Shixiang Wu：验证、方法学、数据分析。Dapeng Peng：撰写、审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（2024YFF1105705、2023YFD1301001）和国家自然科学基金（32373067）的支持。