《Food Bioscience》：Metagenomics-driven discovery of next-generation fermentation biocatalysts: From enzyme mining to synthetic biology applications
编辑推荐：
乳铁蛋白检测方法区分巴氏杀菌与超高温灭菌工艺，通过抗原敏感抗体识别热处理后的LF构象差异，验证乳糖保护作用及其实际应用效果。
Dancai Fan|Zijia Song|Yaya Wang|Binying Fu|Shijie Li|Shuo Wang
天津南开大学医学院食品科学与健康重点实验室，中国天津300071
摘要
准确区分巴氏杀菌和超高温灭菌等乳制品加工技术对于确保产品质量、保护消费者权益以及维护市场秩序至关重要。本研究鉴定出对抗原结构敏感的抗体，并开发了一种高效的双抗体夹心酶联免疫吸附测定（sELISA）检测方法。通过检测乳铁蛋白（LF）在加工过程中的抗原变化，可以识别牛奶的热处理条件。这种抗体对天然LF具有优异的结合亲和力，同时还能识别经过热处理的LF。虽然在75°C下轻微变性会降低其识别效率，但这种变性促进了稳定的乳糖-LF复合物的形成，从而保留了依赖于构象的抗原性。相反，高温和高压联合处理会破坏乳糖的保护作用，使sELISA检测失效。基于实验结果和分子对接分析，乳糖在热处理过程中对LF抗原性的积极作用为区分巴氏杀菌和超高温（UHT）处理提供了关键依据。此外，实际样品的验证表明该方法能够有效区分巴氏杀菌牛奶和UHT牛奶/复原牛奶，为工业质量控制和产品真实性验证提供了技术支持。
引言
作为全球食品系统中不可或缺的组成部分，乳制品因其丰富的营养成分而在人类饮食中占据重要地位[1]、[2]、[3]。随着社会经济的持续发展和居民生活水平的不断提高，消费者的健康意识日益增强，他们对乳制品的需求从“是否有”转向了“质量如何”[4]。除了关注产品的口感和风味外，消费者也越来越重视乳制品的固有品质、安全保障以及来源的真实性[5]。这种消费者需求的提升也对乳制品的生产标准和质量控制提出了更高的要求。
在影响乳制品最终质量的众多因素中，加工技术无疑是核心环节之一，它直接决定了产品的营养保留、安全性能和保质期[6]。目前主流的乳制品加工技术包括巴氏杀菌和超高温瞬时灭菌（UHT），但它们对产品的影响存在显著差异。巴氏杀菌通常采用60-85°C的较低温度，在杀死大多数有害微生物的同时，能够最大限度地保留牛奶中的活性营养素（如免疫球蛋白和乳铁蛋白（LF）及天然风味[7]，但由于杀菌强度有限，产品的保质期较短，通常需要低温冷藏保存[8]。相比之下，UHT工艺使用135-150°C的极高温度进行瞬时处理（仅持续几秒钟），几乎可以完全杀死微生物[9]，从而使产品可以在室温下长期储存，大大提高了流通的便利性。然而，高温不可避免地会导致一些热敏营养素的流失，并可能引发美拉德反应等反应，从而对产品的风味和营养价值产生一定影响[10]、[11]。因此，可靠地识别所使用的加工技术对于保障消费者的知情权和防止标签虚假（例如将UHT牛奶误标为巴氏杀菌牛奶）至关重要，有助于维护高质量的市场秩序。
在众多可用于区分乳制品加工技术的标志物中，乳铁蛋白（LF）因其独特的结构和性质而成为理想的检测目标。作为一种典型的多功能糖蛋白，乳铁蛋白的分子量约为80 kDa。在牛初乳中的含量可达1-2 mg/mL，而在普通牛奶中的含量较低（0.03-0.4 mg/mL）[12]、[13]。LF具有显著的热敏感性，其分子结构在加工过程中对温度变化非常敏感，两个亚基的展开温度范围为60至85°C[14]、[15]。这些特性使得乳铁蛋白成为连接乳制品加工可追溯性和质量评估的核心指标。
基于与目标分子特异性结合的原理，免疫测定技术具有传统物理和化学检测方法无法比拟的优势[16]。这种准确识别结构差异的能力与“热处理参数 - 乳铁蛋白结构变化”的逻辑高度契合，是实现精确工艺区分的基础[17]。尽管已经开发出多种乳铁蛋白检测方法，但大多数方法或多或少避开了乳铁蛋白的热不稳定性这一关键特性[18]、[19]。本研究生成并筛选出了高特异性的抗体对，构建了双抗体夹心酶联免疫吸附测定（sELISA）方法，并利用该方法建立了“乳铁蛋白含量/抗原性-加工技术”关联模型。进一步研究了乳糖结合对LF热稳定性和抗原性的影响，量化了美拉德反应对检测信号和加工识别准确性的干扰。通过结合机制分析和实际样品（巴氏杀菌牛奶、UHT牛奶及多家厂家生产的复原牛奶）的验证，系统评估了sELISA的识别性能。这项工作为加工可追溯性提供了实用工具，并为乳制品质量监管提供了理论和实证支持，推动了乳制品行业的高质量发展。
材料
蛋白质电泳标记物、HRP标记的山羊抗小鼠单克隆抗体（mAb）、胎牛血清（FBS）、DMEM培养基和LDS加载缓冲液（4×）购自美国ThermoFisher Scientific公司；脱脂奶粉（Difco Skim Milk Powder）购自美国BD公司；弗氏完全佐剂（FCA）、弗氏不完全佐剂（FIA）、牛血清白蛋白（BSA）、乳铁蛋白（LF）标准品、酪蛋白（CN）、β-乳球蛋白（β-LG）和α-乳白蛋白（α-LA）标准品、卵白蛋白（OVA）标准品等试剂均购自相关供应商。
不同加工条件下乳铁蛋白的结构验证及sELISA方法的建立
SDS-PAGE电泳图谱直观反映了乳铁蛋白（LF）的聚合和降解情况（图2A）。在仅处理LF的组（泳道1-3）中，LF-25°C组（泳道1）显示出一个约80 kDa的主要条带，与LF的理论分子量一致，且没有明显的杂带，表明LF在自然状态下分子结构完整，未发生聚集或降解[20]。
结论
总结通过抗体筛选、方法优化和机制分析，成功建立了一种能够准确区分乳制品加工技术的sELISA方法。该方法在检测天然LF方面表现出优异的性能，检测限为51.2 μg/L，线性范围为156-10000 μg/L（R2=0.992），且对其他常见牛奶衍生蛋白具有良好的特异性。进一步研究表明，sELISA对LF的识别能力非常显著。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。
作者贡献声明
Shuo Wang：研究指导、方法设计、概念构建。Zijia Song：方法设计、数据整理。Yaya Wang：初稿撰写、实验设计。Binying Fu：初稿撰写、方法设计。Shijie Li：撰写、审稿与编辑、验证、研究指导、资金争取。Dancai Fan：方法设计、数据整理
资助
本研究得到了国家重点研发计划（2023YFF1104700）的资助。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。
