《Food Chemistry》：Tropomyosin-targeted LC-MS/MS for quantitative detection of molluscan allergens in foods: Method validation and application
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本研究开发了基于液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）的靶向检测方法，用于定量分析食品中的贝类过敏原肌动蛋白。通过生物信息学和LC-HRMS技术筛选出两种通用肽段（LAITEVDLER、EDSYEETIR）及物种特异性标志物，验证了方法的高特异性（LOD 1.5-3 mg/kg，LOQ 5-10 mg/kg，回收率70.4%-95.1%，R2>0.995），并应用于25份速冻海鲜水饺检测，发现68%样本含有过敏原，其中82.4%超过致敏阈值（ED05=20 mg）。该方法为复杂基质中贝类过敏原的可靠监测提供了工具。
赵玉萌|杨佩杰|沈城英楠|李思怡|周美珍|高敏|叶峰|张蓉|张雅|李毅|杨树鹏
中国农业科学院食品科学技术研究所农产品加工质量与安全控制创新团队，中国北京100193
摘要
软体动物过敏问题日益引起食品安全关注，但可靠的检测方法仍然有限。本研究开发了一种基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的技术，通过检测肌动蛋白来量化食品中的软体动物过敏原。利用生物信息学和液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）技术，我们鉴定出两种常见的肽（LAITEVDLER、EDSYEETIR）以及物种特异性标志物，并评估了它们的灵敏度、稳定性和抗加工能力。使用同位素标记的标准品进行基质匹配校准，提高了定量准确性。方法验证显示其具有高特异性：检测限（LOD）为1.5–3 mg/kg，定量限（LOQ）为5–10 mg/kg；在饺子样品中，该方法表现出优异的线性（R2 > 0.995），回收率为70.4%–95.1%，精密度（RSD < 11.5%）。对25份商业海鲜饺子的分析显示，68%的样品中含有软体动物过敏原，其中82.4%的阳性样品的过敏原含量超过了过敏反应阈值（ED??，20 mg）。这项验证方法为复杂食品基质中的软体动物过敏原监测提供了一种敏感的工具。
引言
食物过敏是全球范围内的一个重要公共卫生问题，估计影响2–10%的人口，症状从轻微不适到可能致命的过敏性休克不等（Bartha等人，2024；Gupta等人，2019）。食物过敏带来的社会经济负担相当沉重。仅在美国，每年的费用就超过250亿美元，包括医疗费用、生活质量下降以及饮食选择受限（Fong等人，2022）。虽然八大主要食物类别（牛奶、鸡蛋、鱼类、甲壳类海鲜、坚果、花生、小麦和芝麻）导致了大多数过敏反应，但软体动物已成为越来越重要的过敏原，尤其是在海鲜消费量大的地区（FAO，2022；Kamath等人，2022）。普通人群中软体动物过敏的患病率在0.5%到2.5%之间。在与海鲜加工相关的职业环境中，过敏率可能高达5–30%（Khora，2016）。软体动物过敏在临床上表现为多种IgE介导的超敏反应，包括荨麻疹、血管性水肿、胃肠道紊乱和潜在的致命性过敏性休克（Bartha等人，2024；Kamath等人，2022）。尽管软体动物过敏对健康有重大影响，但与其他主要过敏原相比，用于检测和量化食品中这些过敏原的分析方法仍然不够成熟（Blaschke等人，2023；Suh等人，2020；Wong，2025）。这种不足给食品安全监管、过敏原管理和消费者保护带来了重大挑战，凸显了开发灵敏、特异和可靠检测方法的必要性。随着全球食物过敏发病率的上升，以及国际食品贸易的扩大和供应链的复杂性，标准化和验证的软体动物过敏原检测方法变得尤为关键（Blaschke等人，2023；Ruethers等人，2018）。
全球软体动物产量持续增长，年产量超过1700万吨。双壳类（牡蛎、蛤蜊、扇贝、贻贝）和头足类（鱿鱼、章鱼）广泛用于各种食品中（FAO，2022；Ruethers等人，2018）。这些软体动物不仅作为直接食物来源，还作为加工食品的成分、风味增强剂和营养补充剂（Ruethers等人，2018）。软体动物成分在食品供应链中的广泛使用，加上收获、储存和生产过程中的潜在交叉污染，给过敏原管理带来了巨大挑战（Ruethers等人，2018；Wong，2025）。现有的检测方法不足，阻碍了过敏原控制措施的有效验证和产品安全性的确认，可能导致敏感消费者接触到未声明的过敏原（Blaschke等人，2023；Wong，2025）。肌动蛋白被确定为软体动物中的主要过敏原，其热稳定性使其在热处理后仍保持过敏原特性（Ai Emoto & Shiomi，2009；Kamath等人，2013）。这种34–38 kDa的α-螺旋卷曲蛋白在肌肉收缩中起调节作用，并在不同无脊椎动物物种间表现出显著的保守性，序列同源性通常超过70%（Han等人，2025；Rolland等人，2018；Yu等人，2022）。其他在各种软体动物中发现的过敏原包括精氨酸激酶（40 kDa）、肌球蛋白重链（200 kDa）和副肌球蛋白（100 kDa），这些成分共同构成了这些生物体的复杂过敏原谱（Ruethers等人，2018；Wang等人，2025；Zhang等人，2025）。肌动蛋白在食品加工过程中的卓越结构稳定性使其成为理想的检测目标（Kamath等人，2013；Ruethers等人，2018）。然而，它在不同软体动物物种之间以及软体动物与甲壳类动物之间的高序列同源性给物种特异性鉴定带来了挑战，这对于准确的过敏原标记和风险评估至关重要（Huan等人，2022；Xu等人，2022；Yu等人，2022）。了解这些过敏原特性对于开发能够在复杂食品基质中可靠检测软体动物过敏原并将其与其他交叉反应的海鲜过敏原区分开来的方法至关重要。
目前的食物过敏原检测方法主要分为三类：基于DNA的方法、免疫测定法和蛋白质质谱法（Holzhauser，2025；Shencheng等人，2025；Wong，2025；Yang、Chen等人，2024；Yang、Lin等人，2024）。基于DNA的方法，主要是聚合酶链反应（PCR），通过靶向物种特异性DNA序列提供高灵敏度。然而，这些技术检测的是遗传物质而非过敏原蛋白，当加工过程中DNA降解而过敏原蛋白得以保留时，可能会导致假阴性结果（Blaschke等人，2023；Holzhauser，2025）。此外，这些方法无法提供关于实际过敏原含量的定量信息，限制了其在风险评估中的应用（Holzhauser，2025）。免疫测定法，主要是酶联免疫吸附测定（ELISA），利用特定的抗体-过敏原相互作用进行检测。但由于交叉反应问题（尤其是与肌动蛋白相关的交叉反应，因为其序列高度保守且加工引起的结构变化会影响抗体识别），其有效性可能会降低（Wong，2025；Yu等人，2022）。此外，免疫测定法往往无法区分密切相关的物种，在不同抗体来源之间标准化也存在困难（Dong & Raghavan，2022）。LC-MS/MS是一种新兴技术，能够通过检测特征肽标志物直接识别和量化过敏原蛋白（Li等人，2022；Lu等人，2024；Wang等人，2021）。与传统方法相比，该方法具有更高的特异性、多重检测能力和对食品加工影响的抵抗力（临床和实验室标准协会，2021；Wu等人，2024）。新兴的生物传感器技术（如光学和电化学平台）可以实现快速现场筛查食物过敏原，提供及时但通常是定性的或半定量的信息。这些方法对于初步检测具有价值，但在复杂食品基质中可能缺乏所需的特异性和可追溯的定量能力（Zhu等人，2024）。本研究采用的LC-MS/MS方法通过肽水平的确认和绝对定量，补充了上述筛查工具，实现了精确的过敏原评估和风险确定。
近年来，LC-MS/MS技术在食物过敏原检测方面取得了显著进展（Li等人，2022；Wong等人，2025；Wu等人，2024；Yang等人，2024a；Shencheng等人，2025）。多重反应监测（MRM）和平行反应监测（PRM）技术已成为靶向量化过敏原肽的强大策略，提高了灵敏度和选择性（Li等人，2022；Lu等人，2024）。同位素标记肽标准品的开发大大提高了定量准确性，实现了绝对定量和方法标准化（CLSI-C64，2021）。新的样品制备协议结合了酶促消化优化、多过敏原提取程序和靶向富集策略，解决了复杂食品基质相关的问题（Croote等人，2019；Yang等人，2024b）。数据独立采集方法扩展了LC-MS/MS的应用范围，允许同时进行靶向和非靶向分析（Rozanova等人，2021）。此外，高分辨率质谱（HRMS）的进步提高了对翻译后修饰和加工引起的改变的检测能力，这些变化可能影响过敏原性（Rozanova等人，2021）。尽管取得了这些进展，LC-MS/MS在软体动物过敏原检测中的应用仍面临挑战，包括合适的标志肽鉴定、方法标准化和有效样品制备协议的开发（CLSI-C64，2021；Johnson & Downs，2019；Schreiber等人，2018）。现有的关于软体动物过敏原检测的研究主要采用DNA方法和免疫测定法，这些方法存在上述局限性（Blaschke等人，2023；Wong等人，2025；Yu等人，2022）。最近的一些研究展示了LC-MS/MS在海鲜过敏原分析中的潜力，但专门针对软体动物过敏原的综合性研究仍然有限（Li等人，2022；Lu等人，2024；Wu等人，2024）。这些限制突显了开发稳健的LC-MS/MS方法以准确检测和量化加工食品中的软体动物过敏原的紧迫性。我们假设，基于保守的肌动蛋白肽的靶向LC-MS/MS方法能够同时在复杂食品基质中定量检测多种软体动物物种，具有足够的灵敏度以支持过敏原风险评估。
本研究旨在开发一种全面的LC-MS/MS方法，用于定量检测食品中的软体动物过敏原。本研究以肌动蛋白为主要目标蛋白，内容包括：（1）从各种双壳类和头足类物种中筛选和鉴定物种特异性和常见的肽标志物，并评估它们的灵敏度、稳定性和对食品加工处理的抗性；（2）建立适用于不同食品基质的LC-MS/MS检测方法；（3）严格的方法验证；（4）在商业食品产品中的应用以评估性能。这项研究填补了当前软体动物过敏原检测分析能力的关键空白，为监管机构和食品制造商提供了可靠的分析工具，最终增强了消费者保护并支持适当的过敏原管理实践。
化学试剂和样品
三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、碳酸氢铵、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、氯化钾和硫脲购自（Sigma-Aldrich，美国圣路易斯）。甲酸和乙腈购自（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）。序列级修饰胰蛋白酶（TPCK处理）购自（Promega GmbH，美国麦迪逊）。三氟乙酸购自（J.T. Baker，美国菲利普斯堡）。尿素和Bradford蛋白测定试剂盒
肌动蛋白的生物信息学分析
肌动蛋白已被广泛认为是软体动物中的主要过敏原，因此被选为本研究的目标蛋白（Han等人，2025；Ruethers等人，2018）。我们采用LC-MS/MS的靶向蛋白质组学方法来检测和量化酶促消化产生的特征肽。我们的研究策略有两个基本概念：肌动蛋白的标记肽可以作为检测所有软体动物过敏原的通用标志物
结论
本研究建立了一种稳健的LC-MS/MS方法，用于量化食品中的软体动物过敏原，填补了当前分析能力中的重要空白。通过靶向肌动蛋白，我们鉴定并验证了来自不同软体动物物种的物种特异性和常见肽标志物（LAITEVDLER和EDSYEETIR），实现了高特异性、灵敏度（LOD 1.5–3 mg/kg）和准确性（回收率70.4%–95.1%）。将该方法应用于商业海鲜饺子后显示
作者贡献声明
赵玉萌：撰写——初稿、验证、方法学、数据管理。杨佩杰：验证、方法学、数据管理。沈城英楠：方法学。李思怡：数据管理。周美珍：验证。高敏：资源支持。叶峰：资源支持。张蓉：资源支持、方法学。张雅：资源支持。李毅：撰写——审稿与编辑、资金获取。杨树鹏：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、验证、监督、方法学、资金获取、数据管理
资金来源
本研究得到了农业科学技术创新计划（ASTIP）、国家自然科学基金（编号32372444）、新疆重点研究项目（2022B02026-4）和中国农业科学院基础研究创新计划（CAAS-BRC-FNH-2025-03）的财政支持。
未引用的参考文献
New, Schreiber, Stahl-Zeng and Liu, 2018
WHO和FAO, 2022
WHO和FAO, 2023
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
