基于表面增强拉曼光谱和AuNBs@PDA双重信号放大策略，在免疫层析纸上实现对花生过敏原Ara h 3的增强超灵敏检测

《Food Chemistry》：Enhanced ultra-sensitive detection of peanut allergen Ara h 3 on immunochromatographic paper based on surface-enhanced Raman spectroscopy and AuNBs@PDA dual signal amplification strategy

花生过敏原Ara h 3的快速检测方法研究。通过聚多巴胺（PDA）修饰的金自耦合纳米结构（AuNBs@PDA）构建表面增强拉曼散射（SERS）-侧流免疫层析联用平台，实现检测限72.2 pg/mL，灵敏度较传统金纳米颗粒提升295倍，并具备优异的稳定性和可重复性。

　　

作者：杨硕、曲京龙、秦阳、安帅兵、黄凯强、魏亚玲、奚俊

中国河南工业大学食品科学与工程学院，郑州 450001

摘要

花生过敏原Ara h 3对公众健康构成了重大风险。预防接触食物过敏原是保护过敏者的首要方法。因此，我们开发了一种多巴胺（PDA）调控的金自耦合技术，制备出具有多分支结构的等离子体黑体（AuNBs@PDA）。利用AuNBs@PDA的PDA涂层和多分支设计，可以实现高性能的表面增强拉曼散射（SERS）标记。该技术在侧向流动免疫层析试纸（LFIA）中能够超灵敏地检测Ara h 3。SERS-LFIA具有出色的特异性、稳定性和重复性，试纸的保质期超过一年，检测限（LOD）为72.2 pg/mL，比标准AuNPs-LFIA高295倍。这一技术能够准确检测食品样本，为花生过敏监测提供了强大的平台。

引言

花生含有丰富的蛋白质，因其营养价值而被誉为“植物肉”（Pi等人，2019年）。然而，联合国粮食及农业组织将花生列为八大常见过敏原之一（Ekezie、Cheng和Sun，2018年；Li、Yu、Ahmedna和Goktepe，2013年）。对于过敏者而言，即使是最微量的接触也可能引发严重反应，包括腹泻、呕吐，甚至致命后果（Bartha、Almulhem和Santos，2024年）。目前，世界卫生组织和国际免疫学会联盟的官方网站列出了17种已知的花生过敏原蛋白，从Ara h 1到Ara h 18（Ara h 4被确定为Ara h 3.02的亚单位）（Chinthrajah等人，2024年）。值得注意的是，花生过敏原Ara h 3占总可溶性蛋白质的12%–26%，并且能被45%–54%的对花生敏感个体的IgE识别，显示出显著的致敏性（Chen等人，2019年）；它被认为是花生过敏的主要过敏原之一。这也是当前研究的热点蛋白之一。

目前，尚无临床可行的方法来预防和消除花生过敏。降低过敏风险的最佳方法是避免接触花生制品（Dantzer和Kim，2024年）。目前，大多数国家都已实施了包装食品的过敏原标签要求。例如，《食品法典》委员会的规定CXS 1–1985、欧盟的法规No 1169/2011、美国的《食品过敏原标签和消费者保护法》（2004年）以及中国的GB7718-2025（Gunal-Koroglu等人，2025年；Gupta等人，2019年）。这些法规要求食品制造商在包装前明确标注包括花生在内的八大主要过敏原。然而，关于生产和加工过程中可能引入的过敏原化学物质——例如通过共享生产设施或生产线——相关规则和法规主要提倡而非强制要求添加过敏原风险警告。实际上，在同一制造设施或共享生产线上连续加工各种食品仍存在严重的花生过敏交叉污染风险（Bessada、Barreira和Oliveira，2019年；Villa、Costa、Oliveira和Mafra，2018年；Zhu等人，2024年）。这给过敏消费者选择食品带来了困难，也给食品企业和监管机构评估各种食品样本带来了挑战。为了更好地保护花生过敏者，当局必须开发更广泛和可靠的检测方法来识别复杂食品基质中的花生过敏原。

侧向流动免疫测定（LFIA）被公认为是主要的即时检测（POCT）方法，具有出色的特异性、高灵敏度、易用性、快速检测速度和低成本（Li等人，2025年；Ren等人，2025年）。它已被广泛用于快速识别食品中的过敏原。然而，传统的胶体金免疫层析方法在实际应用中受到很大限制，因为其灵敏度较低，假阳性率较高，只能进行定性和半定量检测（Liu等人，2022年；Ren等人，2025年）。

表面增强拉曼散射（SERS）是一种用于检测贵金属（如金、银和铜）不规则表面上分子拉曼散射的技术（Liu等人，2021年）。表面增强拉曼光谱（SERS）是一种基于拉曼散射现象的极其灵敏的光谱方法（Le Ru和Auguié，2024年）。在SERS技术中，将拉曼信号分子引入贵金属纳米材料（金、银、铂等）的表面，会在贵金属表面产生局部增强的电场（热点），从而使靠近金属表面的分子散发的光信号显著增强。这些热点附近的拉曼信号分子显著增强了拉曼信号的强度。与传统拉曼光谱相比，SERS的灵敏度提高了10⁴到10⁶个数量级（Jiang等人，2021年；Sun等人，2019年）。这使得即使在极低浓度下也能精确识别目标化学物质的拉曼信号。近年来，通过将侧向流动免疫层析测试材料与信号放大技术相结合，开发出了SERS侧向流动免疫测定（SERS-LFIA）（Liu等人，2022年；Sun等人，2025年；Sun、Li、Sun、Yin和Liu，2025年）。试纸分子的拉曼信号产生了强烈的SERS信号，这些信号沿着检测线被收集。这使得即使在较低浓度下也能对目标浓度进行定量评估（Wang等人，2019年）。与传统的试纸方法相比，检测限降低了2到3个数量级，灵敏度极高，更适合满足食品中过敏原检测日益增长的需求（Yin等人，2024年）。同时，SERS现象的信号强度与热点的存在、基底的组成以及纳米材料的形态密切相关（Cialla-May等人，2024年；Lee等人，2024年；Logan等人，2024年）。研究表明，靠近热点的拉曼分子显著增强了拉曼信号的强度。这些热点的形成与纳米材料的形态密切相关。此外，当SERS基底的粗糙度较大时，更容易产生局部电场增强效应，从而形成热点（Atta、Zhao、Li和Vo-Dinh，2024年）。这反过来又显著增强了拉曼信号。不幸的是，传统的SERS贵金属胶体基质存在一个局限性，即其纳米颗粒成分之间的静电排斥作用（Anantha、Raj、Zheng、Tanwar和Barman，2025年；Cialla-May等人，2024年）。这种固有性质导致检测过程中纳米颗粒随机聚集，从而影响测量的重复性（Guo等人，2024年）。此外，这些金属胶体基质在实际食品样本的SERS-LFIA检测中的稳定性也容易受到复杂食品基质的影响，这限制了SERS-LFIA在商业和工业中的应用。因此，有必要研究一种具有稳定结构的新型SERS金属胶体基质。

多巴胺（PDA）是一种仿生聚合物，源自贻贝黏附蛋白，通过在温和碱性条件下多巴胺（DA）的氧化自聚反应合成（Wang、Zou、Li和Cheng，2020年；Xu等人，2023年）。PDA含有儿茶酚、醌、氨基和其他活性基团，形成了高度共轭的π电子系统（Cheng等人，2019年）。这一系统赋予了其高化学反应性，使其能够紧密附着在各种表面上，包括有机、无机、非金属和其他材料（Kumar等人，2014年）。此外，PDA的独特性质使其成为构建多种功能性SERS基底的简单而多功能纳米平台（Tian等人，2025年）。一方面，PDA涂层可以用作稳定剂，增强相邻纳米材料的空间位阻，使纳米结构更加分散，胶体更加稳定（Zhang等人，2023年）。另一方面，PDA的o-醌基团与抗体中的氨基或亚氨基之间的迈克尔加成反应促进了与生物分子的简单快速结合（Shao等人，2023年）。因此，利用带有PDA修饰的纳米颗粒作为适当的SERS金属胶体基底，SERS-LFIA的应用前景无限。

在本研究中，我们使用盐酸多巴胺（DA-HCl）作为还原剂，HAuCl₄作为金前体，精确控制DA-HCl与HAuCl₄的添加比例，通过多巴胺（DA）的氧化还原和氧化自聚反应促进金的各向异性生长，从而在表面合成了独特的多分支纳米结构，这种材料具有密集、单分散的金等离子体黑体纳米材料（AuNBs@PDA），具有高度分支的内部结构和独特的多分支表面纳米结构。该材料表现出强烈的比色信号和高抗体结合率。此外，我们首次将拉曼信号分子4-巯基苯甲酸（4-MBA）加载到AuNBs@PDA上，制备出具有强信号强度和稳定结构的拉曼信号探针。将SERS技术与免疫层析试纸结合，实现了信号放大。基于SERS和AuNBs@PDA双重信号放大策略的免疫传感器，能够超灵敏、快速、稳定且便携地检测花生过敏原Ara h 3（图1）。该方法也适用于分析各种形式的复杂食品样本。这不仅有助于识别花生过敏者，还为食品中花生过敏原的监管提供了重要的技术验证。

试剂和材料

本研究中使用的人造花生过敏原Ara h 3、抗Ara h 3小鼠单克隆抗体（mAb）和抗Ara h 3兔多克隆抗体（pAb）由之前的实验室制备。HAuCl₄、DA-HCl、Tris、4-巯基苯甲酸（4-MBA）、NaCl、碳酸钾（K₂CO₃）和金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）购自Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.（中国上海）。所有试剂均为分析级。样品垫、结合垫、层析垫、PV板

AuNBs@PDA的材料表征

我们开发了一种创新的多巴胺介导的生长方法，利用多巴胺作为表面活性剂和还原剂，一步直接制备AuNBs@PDA（图1A）。图1.B显示了在不同HAuCl₄和PDA添加比例下合成的AuNBs@PDA的紫外吸收光谱。当HAuCl₄的体积比为3:1时出现明显的吸收峰。进一步增加HAuCl₄的添加量，局部等离子体共振（LSPR）峰的波长向红移，体积比为4:1时达到522 nm

结论

总之，我们利用创新的多巴胺介导的生长技术成功合成了高度分支的等离子体黑体（AuNBs@PDA），多巴胺既作为表面活性剂又作为还原剂，并通过Au自耦合实现了无种子的共生生长。本研究创新地将AuNBs@PDA与拉曼报告分子4-MBA结合，4-MBA是一种具有优异光学性能、生物相容性、灵敏度和稳定性的多功能SERS标签

CRediT作者贡献声明

杨硕：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，软件，资源，项目管理，数据管理，概念化。曲京龙：撰写 – 审稿与编辑，资源，项目管理，数据管理，概念化。秦阳：验证，监督，资源，正式分析，数据管理。安帅兵：验证，软件。黄凯强：撰写 – 审稿与编辑，可视化。魏亚玲：正式分析。奚俊：撰写

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（NSFC，编号32372441）、河南工业大学Tuoxin团队培养项目（编号2024TXTD07）、河南省“双一流”本科科技创新能力提升专项（编号HN-HautFood IAEM-015）以及2024年河南省大学生创新培训计划（编号202410463008）的支持。