《Food Chemistry》：κ-, ι-, and λ-carrageenan Maillard conjugation enhances whey protein isolate stability during ultra-high-temperature treatment
编辑推荐：
乳清蛋白 isolate（WPI）与三种卡拉胶（κ-, ι-, λ-CG）通过湿加热法（70°C, 0-12h）进行麦拉德型共价修饰，以提升超高温（UHT）处理后的热稳定性和胶体稳定性。研究发现：κ-CG修饰的WPI在UHT后浊度最低（TSI<2.0），ζ电位-25至-28mV，但储存3周后出现相分离；λ-CG修饰的WPI出现蛋白沉淀；而ι-CG修饰的WPI在储存期间保持胶体分散性。不同卡拉胶因硫酸化模式差异，对WPI的热保护机制（即时热稳定或长期储存稳定）和结构-功能关系具有选择性调控作用，为开发高蛋白饮料提供新策略。
赵恩惠|徐惠贞|朴亨秀|金惠真|崔美贞
韩国京畿道平泽市Maeil Health Nutrition公司，食品科学与生物技术系，邮编05029
摘要
本研究探讨了乳清蛋白分离物（WPI）与三种卡拉胶（κ-CG、ι-CG和λ-CG）之间的美拉德型结合反应，旨在提高其在超高温（UHT）处理下的热稳定性和胶体稳定性。通过湿热处理（70°C，0–12小时）在WPI:CG比例为10:1–40:1的条件下制备结合物，并对其结构、组成（氨基酸）和胶体性质（ζ电位、透射电子显微镜观察、Turbiscan稳定性指数[TSI]）进行了分析。
美拉德结合反应（70°C，0–12小时）使变性温度和糖基化程度提高了5–25%，从而增强了抗热性能。经过UHT处理后，WPI/κ-CG结合物的浊度最低，Turbiscan稳定性指数低于2.0，ζ电位为-25至-28 mV。在储存三周后，WPI/κ-CG（10:1，6小时）样品出现了相分离现象，而所有WPI/λ-CG样品均出现了蛋白质沉淀。相比之下，ι-CG结合物保持了良好的胶体分散性，几乎没有聚集现象。这些结果表明，κ-CG在UHT条件下提供了双重稳定作用，而ι-CG在储存过程中表现出更优异的稳定性，显示出其在开发具有定制粘度和长期稳定性的高蛋白饮料方面的潜力。
引言
乳清蛋白分离物（WPI）因其高营养价值和优异的工艺功能特性（如溶解性、乳化性和凝胶化能力）而在食品工业中得到广泛应用（Doost等人，2019年）。这些特性使得WPI成为高蛋白即饮饮料（RTD）和其他热加工食品系统的理想蛋白质来源（Lee & Lee，2021年）。然而，WPI的一个关键局限性是其固有的热不稳定性，尤其是在工业灭菌过程中遇到的高温和剪切条件下（Julmohammad等人，2021年）。β-乳球蛋白（β-Lg）和α-乳白蛋白（α-La）的主要成分是通过二硫键和疏水相互作用稳定的球状蛋白质（Spotti等人，2014年）。在高温下，这些蛋白质会发生热变性，导致疏水残基和巯基暴露，从而通过疏水相互作用和二硫键交换促进分子间聚集（Chen & Zhang，2020年）。这种不可逆的结构变化会降低溶解度并促进不溶性聚集体的形成（Wang & Zhong，2014年）。在超高温（UHT）处理过程中，这一问题更加明显，因为UHT是一种常见的RTD蛋白质饮料灭菌方法，能够在保持商业无菌性的同时将风味和营养损失降至最低（Seo & Oh，2022年）。尽管具有技术优势，但UHT处理常常会导致蛋白质快速聚集，从而增加浊度和粘度，并引发相分离，影响产品的物理和感官品质（Alancay等人，2023年）。
为了解决乳清蛋白在高温处理过程中的热不稳定性问题，美拉德型结合反应作为一种天然的、非酶促修饰方法被广泛研究。在该反应中，赖氨酸残基的ε-氨基与还原糖或多糖的羰基发生反应，从而改变蛋白质表面性质并提高稳定性。先前的研究表明，蛋白质-多糖结合物（如卵清蛋白-葡聚糖或溶菌酶-葡聚糖）比天然蛋白质具有更好的稳定性，并具有额外的功能，如抗氧化或抗菌活性（Chevalier等人，2001年；Kato等人，1990年；Nakamura等人，1991年；Nakamura等人，1992年；Shu等人，1996年）。后续研究进一步证实，与葡聚糖或阿拉伯胶结合可以显著提高β-Lg的热稳定性和溶解度，通过增加界面厚度和减少热诱导的聚集（Dunlap & C?té，2005年；Wooster & Augustin，2006年）。总体而言，这些研究为将美拉德结合反应应用于乳制品蛋白质奠定了坚实的科学基础，以增强其在高温食品加工中的功能性和结构稳定性。然而，并非所有多糖都适合作为WPI的美拉德反应伙伴。阿拉伯胶作为一种常用的天然乳化剂，是一种高度分支的阿拉伯半乳聚糖-蛋白质复合物，分子量较低且电荷接近中性，这限制了其形成稳定共价结合物的能力，并且难以有效抵抗UHT引起的聚集（Agustinisari等人，2024年）。麦芽糊精价格低廉且溶解度较高，但电荷和构象刚性较低，在热应力下提供的静电或空间保护作用有限（Doost等人，2020年）。果胶在酸性饮料中有效，但由于其凝胶化特性，在中性pH下其强负电荷会导致与乳清蛋白的静电排斥，从而引发相分离（Seo & Oh，2022年）。
相比之下，卡拉胶（CG）是由交替连接的3-连接的β-D-半乳吡喃糖和4-连接的α-D-半乳吡喃糖单元组成的线性硫酸化半乳聚糖，其中硫酸基团的取代位置和密度各不相同（例如，κ-CG在C-4位置，ι-CG在C-2位置，λ-CG在多个位置）。这些差异决定了它们的电荷分布、分子构象和凝胶行为（Hoffmann等人，1995年；Huang等人，2024年；Uno等人，2001年）。κ-CG、ι-CG和λ-CG每重复二糖单元分别含有大约一个、两个和三个硫酸酯基团，它们在取代位置（C-4、C-2）和整体电荷密度上存在差异（Huang等人，2024年）。这些硫酸基团含量和电荷分布的差异使每种卡拉胶类型能够以独特的方式与蛋白质相互作用，从而调节所得结合物的结构和功能特性（Xu等人，2024年）。这些结构差异表现为不同的功能：κ-CG通过螺旋聚集形成强且可逆的凝胶；ι-CG由于额外的硫酸基团取代而产生更弹性、更不易碎的凝胶；λ-CG虽然不形成凝胶，但能提供高电荷密度，从而提高溶解性和静电稳定性（Bui等人，2019年；Running等人，2012年）。在蛋白质结合系统中，结构-功能关系尤为重要，因为硫酸化模式和构象刚性可能影响结合效率、空间阻碍以及静电与共价稳定的平衡（Babu等人，2024年；Necas & Bartosikova，2013年）。因此，κ-CG、ι-CG和λ-CG不仅是技术上重要的亲水胶体，也是研究结构基序如何影响热加工过程中蛋白质-多糖结合功能的重要多糖。
在这些多糖中，卡拉胶特别具有吸引力，因为它具有高电荷密度、分子刚性和广泛的功能性（Kan等人，2024年）。由于其硫酸基团，卡拉胶表现出强烈的阴离子特性，这可能有助于与蛋白质更有效的静电相互作用，从而提高糖基化效率和结构稳定性（Seo & Yoo，2021年）。此外，κ-CG、ι-CG和λ-CG在硫酸基团取代模式、分子结构和分子量上存在差异，κ-CG形成热可逆凝胶，而ι-CG和λ-CG则具有不同的链柔韧性和电荷密度（Hoffmann等人，1995年；Uno等人，2001年）。这些差异预计会影响结合效率、胶体稳定性以及最终产品在UHT条件下的质量。然而，关于这三种卡拉胶在WPI系统中的美拉德结合反应的系统性比较仍然较少。
以往关于卡拉胶与牛奶或乳清蛋白之间美拉德型结合的研究主要集中在改善中等温度条件下的通用功能特性，如溶解性、粘度或流变稳定性（Seo & Oh，2022年；Seo & Yoo，2021年）。这些研究证实了卡拉胶与蛋白质结合的基本可行性，但未探讨这类结合物在工业UHT处理条件下（即蛋白质广泛展开、聚集和长期分散不稳定的情况下）的表现。相比之下，研究表明，与植物来源的多糖进行美拉德型结合可以增强乳制品蛋白质在UHT条件下的热稳定性和胶体稳定性（Cho等人，2025年）。然而，尚不清楚基于卡拉胶的结合物在实际UHT处理过程中是否表现出类似或不同的热保护行为，以及不同类型的卡拉胶在稳定机制上的差异。
因此，本研究旨在阐明κ-CG、ι-CG和λ-CG与WPI的美拉德型结合如何影响其在UHT处理下的热稳定性、聚集行为和结构完整性。通过比较具有不同硫酸化模式的卡拉胶类型，本研究揭示了类型依赖的稳定行为，这些行为在即时UHT抗性和长期储存稳定性之间存在差异，并建立了与设计耐热高蛋白饮料相关的结构-功能关系。
材料
乳清蛋白分离物（WPI，纯度≥86%）购自韩国京畿道平泽市的Maeil Health Nutrition公司。根据供应商提供的规格，WPI的成分如下：蛋白质90.0%，碳水化合物0.2%，脂肪0.2%，灰分6.0%，水分5.6%。κ-卡拉胶（κ-CG，目录编号234-350-2）、ι-卡拉胶（ι-CG，目录编号232-949-3）和λ-卡拉胶（λ-CG，目录编号232-949-3）购自日本东京的Tokyo Chemical Industry（TCI）公司。
糖基化程度（DG）
糖基化程度（DG）是WPI的氨基与卡拉胶还原末端之间美拉德反应进展的直接指标。如图1A所示，即使在没有卡拉胶的情况下（p < 0.05），HWPI在最初的3小时内也显示出适度但显著的DG增加。这种早期上升可以归因于WPI与乳清蛋白中天然存在的微量乳糖或残留还原糖之间的分子内和分子间糖基化，以及可能的Schiff碱形成。
结论
本研究证明，在湿热条件下，乳清蛋白分离物（WPI）与κ-CG、ι-CG和λ-CG的美拉德型结合显著提高了其对UHT诱导的变性和聚集的抵抗力，其稳定行为强烈依赖于卡拉胶类型和结合程度。与经过UHT处理的HWPI相比，后者表现出严重的结构破坏和较差的胶体稳定性，而所有WPI-CG结合物均表现出改善的热稳定性和分散稳定性。
作者贡献声明
赵恩惠：撰写初稿、可视化处理、验证、方法学设计、数据分析、数据整理。徐惠贞：可视化处理、实验研究。朴亨秀：实验研究、数据分析。金惠真：方法学设计、数据整理、概念构思。崔美贞：撰写、审稿与编辑、项目管理、概念构思。
声明与披露
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
未引用参考文献
Buggy, McManus, Brodkorb, Hogan and Fenelon, 2018
Chen et al., 2022
Dursun Capar and Yalcin, 2024
ter Haar, Schols and Gruppen, 2011
Li, Zhao, Li and Yu, 2021
Liu, Ma, McClements and Gao, 2016
Ong, Steele and Duizer, 2018
Soltanahmadi, Wang, Gul, Stribi?caia and Sarkar, 2023
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了韩国食品、农业和林业技术规划与评估研究所（IPET）通过高附加值食品技术开发计划的支持，该计划由
农业、食品和农村事务部（MAFRA）资助（RS–2024–00403662）。
