《Food Chemistry: Molecular Sciences》：Real-time PCR to target
Hoodia in herbal supplements: a tool for conservation and trade regulation
编辑推荐：
本研究针对因过度采伐和非法贸易而濒危的天人菊属(Hoodia)植物在保健品中的掺假问题，开发了一种高特异性、高灵敏度的实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法。该方法靶向核糖体DNA内部转录间隔区2(ITS2)分子标记，经验证可有效检测商业减肥保健品中的天人菊属成分，为CITES公约监管和产品真实性验证提供了强大的分子工具。
在追求健康与苗条身材的浪潮中，源自南非的仙人掌状多肉植物——天人菊属(Hoodia)植物，因其传闻的抑制食欲特性而声名鹊起，尤其是霍迪亚(Hoodia gordonii)等物种被广泛添加到草本减肥保健品中。然而，巨大的市场需求导致了野生天人菊属植物的过度采伐，这种生长缓慢的植物群落面临严重的生存威胁。为此，《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)将整个天人菊属列入附录II，对其国际贸易实行严格管制。更为严峻的是，供应链的短缺催生了猖獗的掺假行为，例如常用仙人掌(Opuntia ficus indica)冒充霍迪亚，许多市售产品中天人菊属含量微乎其微甚至完全没有。这不仅涉及商业欺诈，更可能因成分不明带来潜在的健康风险。此外，临床研究并未证实其显著的减肥效果，反而报告了心血管和神经系统的不良反应，导致多个国家禁止其在食品补充剂中使用。在欧洲市场，含天人菊属的保健品被归类为新型食品，未经授权不得销售，但违规产品仍屡禁不止。面对这些挑战，监管机构亟需一种可靠、高效的检测方法来监控非法贸易、验证产品真实性，从而保护消费者权益并支持濒危植物保护。然而，传统的形态学鉴定和化学分析方法在面对高度加工的保健品时存在局限，而现有的DNA检测方法如常规PCR结合电泳或测序，则存在灵敏度低、操作繁琐或对混合物检测能力不足等问题。
为了应对这一迫切需求，本研究团队开发并验证了一种新型的实时荧光PCR(real-time PCR)方法，专门用于检测天人菊属植物。这项研究发表在《Food Chemistry: Molecular Sciences》上。实时荧光PCR技术因其高灵敏度、特异性、快速且能避免开盖污染等优点，已成为检测领域的金标准。研究团队选择核糖体DNA的内部转录间隔区2(ITS2)作为靶标，这是一个在多拷贝核基因组中存在的区域，其序列在物种间具有高度变异性，而在种内相对保守，非常适合用于植物物种的鉴别鉴定。
本研究的关键技术方法主要包括：首先，研究人员从多个来源收集了13份天人菊属植物材料，覆盖7个不同物种，并通过DNA条形码(DNA barcoding)技术测定了其ITS2区域序列，弥补了公共数据库中该属序列数据的不足。其次，基于获得的29条天人菊属ITS2序列（包括公共数据库和本研究新生成的），通过序列比对，精心设计并筛选出具有高特异性的引物(Hoodia-F, Hoodia-R)和探针(Hoodia-P)。值得一提的是，为了最大限度地避免与近缘物种的交叉反应，研究还额外设计了两个竞争性探针(non-Hoodia-Pa, non-Hoodia-Pb)，并采用了锁核酸(LNA)修饰的TaqMan探针以增强杂交特异性。最后，严格遵循欧洲转基因生物检测实验室网络(ENGL)发布的最低性能要求(MPR)，对建立的实时荧光PCR方法进行了全面的性能验证，包括特异性、灵敏度、实验室间可转移性以及在实际保健品样本中的应用性测试。
3.1. 内部ITS2序列生成与实时荧光PCR的计算机设计
研究人员发现公共数据库中天人菊属ITS2序列十分有限，仅为16条。为此，他们额外生成了13条来自不同天人菊属物种的ITS2序列，构建了包含29条序列的数据集，为高特异性引物和探针的设计奠定了坚实基础。通过序列比对，他们成功设计出靶向88 bp ITS2片段的引物和探针。计算机模拟分析证实，该方法对所有测试的天人菊属序列均具有100%的覆盖度和匹配度（ inclusivity ）。尽管计算机模拟显示该方法对非天人菊属序列无完全匹配，但考虑到近缘物种序列相似度高，可能存在交叉反应风险，研究人员创新性地引入了两个竞争性非目标探针，结合LNA技术，旨在实验层面确保检测的特异性。
3.2. 开发的实时荧光PCR方法的实验性能评估
3.2.1. 特异性
实验结果表明，该方法对13份涵盖7个物种的天人菊属DNA样本均能产生特异性扩增信号，无一漏检（假阴性）。同时，对41份非目标DNA样本（包括17份近缘植物如Caralluma属、10份常见于减肥保健品中的植物如苦橙(Citrus aurantium)、瓜拉纳(Paullinia cupana)等、10份常见作物以及4份非植物（人、微生物）样本）进行检测，均未出现非特异性扩增（假阳性）。测序验证证实扩增产物的序列与预期完全一致。该方法展现了卓越的属级检测特异性。
3.2.2. 灵敏度
使用包含单拷贝目标序列的合成DNA片段(gBlocks)进行灵敏度测试。通过概率检测(POD)模型计算，该方法的检测限(LOD95%)约为10个目标拷贝数，符合ENGL对于灵敏度的要求（低于25拷贝）。这表明该方法能够检测出样品中极微量的天人菊属DNA，这对于检测可能高度加工且目标DNA含量低的保健品至关重要。
3.2.3. 可转移性
将建立的方法转移至一个外部实验室（法国斯特拉斯堡SCL实验室）进行验证。外部实验室的灵敏度测试结果与内部验证结果高度一致，LOD95%计算为约6个目标拷贝数，证明了该方法在不同实验室、不同操作人员及仪器（CFX Duet系统）间的稳健性和可转移性，为其在多个执法实验室的推广应用提供了支持。
3.2.4. 适用性
将该方法应用于10种从欧洲市场采集的商用草本减肥保健品。结果显示，在5种标示含天人菊属的产品中检测到了天人菊属DNA，其中4种的结果与液相色谱-质谱联用(LC-MS)化学分析结果一致。对于一种化学分析未检出但实时荧光PCR检出的样品（样品5），其Cq值较高（33.1），提示天人菊属含量极低，可能低于化学方法的检测限，凸显了DNA检测方法在痕量分析中的优势。在3种标示含天人菊属但两种方法均未检出的样品中，可能存在标签错误或含量低于方法检测限的情况。2种未标示含天人菊属的样品中均未检出，与预期相符。此外，使用通用植物实时荧光PCR检测确认了大部分样品中存在可扩增的植物DNA，说明了DNA质量评估的重要性。
本研究成功开发并验证了首个用于检测天人菊属植物的实时荧光PCR方法。该方法靶向ITS2区域，具有高特异性、高灵敏度（LOD95%~10拷贝）、良好的实验室间可转移性，并能成功应用于复杂的商业保健品基质检测。该研究不仅提供了经过国际标准验证的、用户友好的分子检测工具，直接服务于执法实验室对濒危物种贸易监管和保健品真实性验证的需求，也为解决其他珍稀濒危或易掺假植物的检测难题提供了可借鉴的技术路线。通过提供这一可靠的分析手段，本研究为保护生物多样性、规范市场秩序、保障消费者权益和食品安全做出了重要贡献。未来通过组织国际协同对比试验，将进一步推动该方法的标准化和广泛应用。
