《Food Chemistry: X》：Understanding the impact of oat groat heat treatment on its protein extractability
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本研究针对工业热处理（kilning）导致燕麦蛋白提取率下降的问题，系统探讨了其分子机制。通过比较未热处理、实验室热处理及工业热处理燕麦米的全麦、麸皮富集及胚乳富集组分，发现热处理虽未引起显著蛋白变性，但诱导了蛋白质二级结构转变（α-螺旋/无规卷曲减少，β-折叠增加）及通过非共价相互作用和二硫键形成的蛋白聚集，从而显著降低蛋白提取率。该研究为改善燕麦基液态食品中蛋白提取效率提供了理论依据。
随着植物基饮食的兴起，燕麦（Avena sativa L.）因其高蛋白含量（干物质11–18%）而备受关注，其中70–80%为球蛋白，主要成分为12S球蛋白。这种球蛋白是由54 kDa单体通过非共价相互作用形成的320 kDa六聚体，每个单体又由一个酸性α亚基（32 kDa）和一个碱性β亚基（22 kDa）通过一个二硫键连接而成。燕麦球蛋白具有水相提取潜力，非常适合应用于植物基乳制品替代品。然而，目前市场上的燕麦饮料和酸奶替代品蛋白质含量普遍较低，这凸显了燕麦蛋白固有的低提取率问题。在传统的燕麦加工行业（主要涉及固态食品应用），蛋白质提取率并非关键考量。但在燕麦基乳制品替代品的背景下，蛋白质提取率变得尤为重要。不幸的是，工业上对燕麦米进行的热处理（称为“kilning”）会显著降低蛋白质的提取率，这不利于燕麦基液态和半固态食品的应用。先前研究观察到热处理后燕麦蛋白提取率从75%降至36%（pH 9.5）或从86%降至21%（pH 9.0）。此外，物理封装（如细胞壁屏障）也影响其提取率。虽然显微镜观察发现工业热处理后燕麦米横截面中糊粉层细胞内物质发生显著凝集，推测与蛋白提取率下降有关，且这种可见影响主要限于糊粉层，但蛋白提取率的显著降低表明亚糊粉层和淀粉质胚乳中的蛋白质很可能也受到了热处理的影响。先前有观点认为提取率下降是由于蛋白质（部分）变性和聚集，但缺乏实验证据支持。因此，阐明工业热处理影响燕麦蛋白提取率的机制至关重要。
为了回答上述问题，研究人员比较了未热处理（NHT）、实验室热处理（LHT，90°C，45分钟，优化条件以实现过氧化物酶完全失活但蛋白提取率高于工业热处理）和工业热处理（IHT，具体条件未知，但已知能完全灭活过氧化物酶）燕麦米。研究制备了脱脂燕麦全麦粉（DOW）以及通过筛分（125 μm筛网）得到的麸皮富集组分（BEF）和胚乳富集组分（EEF）。为了区分物理屏障和蛋白质本身变化的影响，部分样品还进行了低温球磨（CM）以破坏细胞结构。随后，系统分析了样品的灰分和蛋白质含量、过氧化物酶和脂肪酶活性、蛋白质提取率（pH 9.0）、蛋白质热性质（差示扫描量热法，DSC）、蛋白质二级结构（傅里叶变换红外光谱，FTIR）以及蛋白质组成和聚集状态（尺寸排阻高效液相色谱，SE-HPLC，在变性非还原条件（NaP + U + SDS）和变性还原条件（NaP + U + SDS + DTT）下进行）。
本研究主要运用了几项关键技术方法：1）样品制备与分级：对未热处理、实验室热处理和工业热处理燕麦米进行研磨、脱脂，并通过筛分（125 μm）获得麸皮富集组分和胚乳富集组分，部分样品进行低温球磨以破坏细胞结构。2）酶活性测定：使用分光光度法测定过氧化物酶和脂肪酶活性，以验证热处理效果。3）蛋白提取率测定：在pH 9.0条件下提取蛋白，采用Lowry法测定蛋白浓度并计算提取率。4）蛋白热性质分析：利用差示扫描量热法（DSC）分析蛋白变性温度和焓变。5）蛋白二级结构分析：通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析酰胺I区（1600–1700 cm-1），通过曲线拟合定量α-螺旋/无规卷曲（1643–1659 cm-1）、分子内β-折叠（1628–1642 cm-1）、分子间β-折叠（1610–1627 cm-1）和β-转角（1660–1700 cm-1）的相对含量。6）蛋白聚集状态分析：使用尺寸排阻高效液相色谱（SE-HPLC）在变性非还原（NaP + U + SDS）和变性还原（NaP + U + SDS + DTT）条件下分析蛋白表观分子量分布和提取率，以评估非共价相互作用和二硫键在蛋白聚集中的作用。
3.1. 灰分和蛋白质含量
低温球磨后的脱脂燕麦全麦粉（CM-DOW）的灰分和蛋白质含量分别为2.5%和14.3%（干物质），与文献报道一致。热处理未显著改变CM-DOW的灰分和蛋白质含量。麸皮富集组分（CM-BEF）的灰分（4.6%）和蛋白质含量（29.3%）高于胚乳富集组分（CM-EEF，灰分1.9%，蛋白质含量11.3%），这与外层组织矿物质和蛋白质更丰富相符。工业热处理和实验室热处理后，CM-BEF的蛋白质含量显著降低，而CM-EEF的蛋白质含量在工业热处理后显著升高，这可能与热处理后燕麦米硬度变化导致粉碎和筛分行为不同有关。
3.2. 过氧化物酶和脂肪酶活性
未热处理脱脂燕麦全麦粉（DOWNHT）的过氧化物酶和脂肪酶活性分别为12.6 U/g dm和1.4 U/g dm。工业热处理和实验室热处理后，所有样品（DOW、BEF、EEF）的酶活性均降至检测限以下，表明两种热处理均能有效灭酶，且热量传递至燕麦米整体。BEFNHT的酶活性高于EEFNHT，这与脂肪酶主要位于籽粒外层和胚部的报道一致。
3.3. 蛋白质提取率
在pH 9.0条件下，未热处理脱脂燕麦全麦粉（DOWNHT）的蛋白质提取率为67.2%，工业热处理后（DOWIHT）显著降至22.5%，实验室热处理（DOWLHT）为48.6%。类似趋势也出现在BEF和EEF中：BEFNHT提取率为65.9%，BEFIHT降至22.9%，BEFLHT为42.8%；EEFNHT提取率最高（77.6%），EEFIHT降至23.0%，EEFLHT为57.0%。工业热处理对全籽粒各部位蛋白提取率影响均显著，而实验室热处理主要影响外层蛋白提取率。对于未热处理和实验室热处理样品，胚乳富集组分的蛋白提取率均高于麸皮富集组分，可能与麸皮中厚细胞壁（主要成分为阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖）的物理阻碍有关。低温球磨后，所有样品的蛋白提取率均有所提高，证实物理屏障是限制因素。然而，即使经过低温球磨，热处理样品（CM-DOWIHT, CM-DOWLHT, CM-BEFIHT, CM-BEFLHT）的蛋白提取率仍显著低于相应的未热处理样品，表明除物理屏障外，蛋白质本身的变化是导致提取率下降的主要原因。低温球磨对胚乳富集组分提取率的影响较小，可能与胚乳细胞壁较薄有关。
3.4. 蛋白质热性质
DSC分析显示，所有样品在约110°C处存在一个吸热峰，对应于燕麦球蛋白的变性。未热处理、实验室热处理和工业热处理脱脂燕麦全麦粉（CM-DOW）的变性温度（Td）分别为111.7°C、111.4°C和111.3°C，变性焓（ΔH）分别为4.5 J/gprotein、3.7 J/gprotein和4.2 J/gprotein，热处理未引起变性焓的显著变化，表明热处理并未导致显著的蛋白质变性。麸皮富集组分的变性焓普遍高于胚乳富集组分，表明即使未热处理，麸皮中的燕麦球蛋白也存在更多和/或更强的蛋白质相互作用。
3.5. 蛋白质二级结构
FTIR分析表明，未热处理脱脂燕麦全麦粉（CM-DOWNHT）的蛋白质二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主（合计50%），其次是分子内β-折叠（17%）、β-转角（19%）和分子间β-折叠（15%）。热处理导致α-螺旋和无规卷曲含量下降，分子内β-折叠含量增加。这种变化在工业热处理样品中尤为显著：DOWIHT的α-螺旋/无规卷曲降至44%，分子内β-折叠增至27%。类似趋势也出现在BEF和EEF中，但工业热处理对BEF二级结构的影响更为明显（BEFIHT的α-螺旋/无规卷曲降至42%，分子内β-折叠增至32%）。相关性分析显示，蛋白提取率与α-螺旋/无规卷曲含量呈显著正相关，与分子内β-折叠含量呈负相关趋势。这些局部二级结构的变化可能促进了蛋白质聚集。
3.6. 蛋白质组成和聚集状态
SE-HPLC分析显示，主要蛋白成分为54 kDa的12S球蛋白单体。在变性还原条件下，该单体可解离为~35 kDa的酸性α亚基和~26 kDa的碱性β亚基。在变性非还原条件下，工业热处理样品的蛋白提取率（CM-DOWIHT: 60.4%; CM-BEFIHT: 59.2%; CM-EEFIHT: 60.6%）显著低于未热处理样品（CM-DOWNHT: 86.6%; CM-BEFNHT: 91.3%; CM-EEFNHT: 83.3%）和实验室热处理样品。而在变性还原条件下，所有样品的蛋白提取率均接近完全（90-100%）。这表明热处理导致了由二硫键稳定的蛋白聚集体的形成，且其程度随热处理强度增加而加剧。比较pH 9.0提取率和变性非还原条件提取率发现，热处理样品在pH 9.0的提取率更低，表明还存在由非共价相互作用稳定的蛋白聚集体。非共价聚集在胚乳富集组分中更为突出，而二硫键聚集在麸皮富集组分中略占主导。
本研究首次系统地揭示了燕麦米热处理影响蛋白提取率的机制。结果表明，工业热处理和实验室热处理均能有效灭活酶，但工业热处理更为剧烈，显著降低了整个燕麦米中蛋白质的提取率。物理屏障（如细胞壁）是限制提取的因素之一，但蛋白质本身的结构变化和聚集是导致提取率下降的更主要原因。热处理并未引起燕麦球蛋白的显著变性，但诱导了蛋白质二级结构的转变（α-螺旋/无规卷曲减少，β-折叠增加）以及通过非共价相互作用和二硫键形成的蛋白质聚集。热处理对蛋白质二级结构和二硫键聚集的影响在燕麦米外层更为显著，而非共价聚集在胚乳中更为突出。这些发现为开发针对工业热处理燕麦米的蛋白质提取策略（例如利用超声波等技术解聚蛋白）提供了重要的理论依据，有助于在保持蛋白质天然三级结构的同时提高提取率，从而更好地发掘工业热处理燕麦米中蛋白质的营养和技术潜力。未来的研究应进一步探讨热处理对燕麦蛋白功能性质（如起泡、乳化和凝胶特性）的影响，并评估热处理及整个燕麦基乳制品替代品生产过程对蛋白质消化率的影响。
