《Food Chemistry: X》：Alleviation of structural deterioration in gluten and its components during freeze–thaw cycles by deacetylated konjac glucomannan
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本研究针对冷冻面团在冻融循环中面筋蛋白结构易发生解聚-聚集劣变的问题，探讨了不同脱乙酰度(DKGM)的魔芋葡甘聚糖对冷冻面筋及其组分（谷蛋白和醇溶蛋白）结构稳定性的影响。结果表明，DKGM能有效维持面筋蛋白的二、三级结构，保留更高的非共价相互作用和二硫键，其中中等脱乙酰度(DK2, DD=50.21%)对谷蛋白的保护效果最佳，而高脱乙酰度(DK3, DD=66.61%)对醇溶蛋白的保护更有效。该研究为多糖类冷冻保护剂在冷冻食品中的应用提供了理论依据。
随着冷冻技术的发展，冷冻面团制品已实现工业化大规模生产，并显著延长了货架期。然而，在储存过程中，温度波动会严重影响冷冻面团的质量，主要表现为气体保持能力和流变特性的下降。这一劣变过程与面筋蛋白的结构破坏密切相关，面筋蛋白作为面团的“骨架”，其结构稳定性对最终产品质量起着决定性作用。面筋蛋白主要由谷蛋白(glutenin)和醇溶蛋白(gliadin)组成。在冻藏过程中，冰晶的重结晶会破坏面筋蛋白的共价键和非共价键，导致高分子量谷蛋白亚基解聚，醇溶蛋白则可能破坏谷蛋白大聚集体，从而使面筋膜变薄，最终损害冷冻面团的品质。因此，如何有效减缓面筋蛋白在冻融循环中的结构劣变，成为冷冻食品工业面临的重要挑战。
近年来，添加亲水性多糖被认为是一种有效、安全且经济的策略，用以提高面筋蛋白的冷冻稳定性。已有研究表明，多糖的结构特征对其在面筋体系中的冷冻保护性能至关重要。魔芋葡甘聚糖(KGM)是一种中性水溶性多糖，因其显著的增稠、凝胶和乳化特性而备受关注。然而，KGM的强吸湿性会干扰面筋网络的形成，使面团在发酵过程中容易发生结构塌陷。部分脱乙酰化的魔芋葡甘聚糖(DKGM)则表现出降低的湿度敏感性和改善的机械强度。近期研究进一步揭示，DKGM在冷冻面团中显示出潜在的冷冻保护潜力，且其效果取决于脱乙酰度(DD)。尽管已有研究报道DKGM与二硫键形成和增强有序面筋结构有关，但关于不同DD的DKGM对面筋蛋白网络聚集状态及其组分相互作用的影响仍知之甚少。
为了深入探究这一问题，发表在《Food Chemistry: X》上的研究论文《Alleviation of structural deterioration in gluten and its components during freeze–thaw cycles by deacetylated konjac glucomannan》系统研究了不同脱乙酰度的DKGM在冻融循环中对面筋及其组分结构完整性的影响，重点关注了蛋白质结构和多糖-蛋白质相互作用。研究人员通过制备不同脱乙酰度的DKGM（DK1: DD=31.31%; DK2: DD=50.21%; DK3: DD=66.61%），并将其以0.6% (w/w)的浓度添加到面筋、谷蛋白和醇溶蛋白中，经过0、1、2、3次冻融循环（-18°C冷冻20小时，30°C解冻4小时）后，采用多种技术手段进行分析。主要关键技术方法包括：利用荧光光谱分析面筋蛋白的固有荧光光谱和表面疏水性；通过原子力显微镜(AFM)和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察面筋蛋白分子链构象和微观结构；测定游离巯基(SHfree)含量和非共价相互作用（离子键、氢键、疏水相互作用）以评估分子间作用力；采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析蛋白质二级结构；通过蛋白质电泳分析亚基分布；并运用分子对接模拟DKGM与蛋白质（谷蛋白PDB ID: P10387；醇溶蛋白PDB ID: P04726）之间的相互作用。
3.1. 固有荧光光谱分析
研究人员通过分析面筋蛋白的固有荧光光谱（主要由色氨酸残基贡献），发现与对照组(CK)相比，添加DKGM诱导了最大发射波长(λmax)的红移，表明DKGM促进了色氨酸残基周围更亲水的微环境。随着冻融循环的进行，红移幅度减小，这可能是冰晶重结晶破坏了面筋微环境所致。添加DKGM后，面筋蛋白的最大固有荧光强度(Imax)随DD增加先降低后升高，DK2组在冻融0周期时Imax最低。这归因于多糖-蛋白质通过共价和非共价键相互作用促进聚集体形成，部分掩蔽了色氨酸残基并稳定了面筋网络。经过3次冻融循环后，DK2和DK3组显示出更高的Imax值，表明中等和高DD水平能更好地保存色氨酸微环境，减少冻融引起的荧光猝灭。
3.2. 表面疏水性分析
表面疏水性是蛋白质三级结构的重要指标。研究发现，与KGM组相比，添加DK1、DK2和DK3分别使面筋蛋白的表面疏水性降低了8.85%、14.03%和13.69%，这与固有荧光结果一致。这种降低表明DKGM改变了面筋蛋白的空间构象，增加了内部疏水性和结构稳定性。随着冻融循环的进行，所有组的表面疏水性均下降并在冻融2周期后趋于稳定。在冻融3周期时，DKGM组的表面疏水性高于KGM组（DK1、DK2、DK3分别增加0.76%、4.83%和4.59%），表明DKGM在冻融循环中防止了面筋蛋白构象的过度聚集。
3.3. 面筋链分析
通过原子力显微镜观察面筋蛋白分子链的构象发现，小麦面筋呈现由岛状和条带状聚集体（亮区）组成的网络结构。在冻融0周期时，添加DKGM后亮区比例增加，表明DKGM促进了面筋蛋白的聚集。这归因于多糖调节二硫键并通过疏水和氢键相互作用促进聚集体形成。经过3次冻融循环后，对照组呈现出更宽的亮区和增加的聚合物高度，表明冻融过程中面筋链发生聚集。冻融可能导致面筋蛋白的机械损伤，增加其柔性，并通过形成分子间相互作用增强其聚集倾向。相比之下，中等和高DD的DKGM组（DK2和DK3）在冻融3周期时显示出更均匀的链分布，表明形成了更稳定的结构，缓解了面筋的聚集。
3.4. 面筋微观结构
共聚焦激光扫描显微镜图像显示，多糖分散在面筋蛋白网络的孔隙中，表现出“填充效应”。在DK3组中观察到大的多糖聚集体，这表明高DD的DKGM倾向于通过分子内羟基间的氢键发生自聚集，从而影响稳定面筋网络的形成。DKGM的添加增加了面筋网络的平均孔径，这可能是由于多糖-面筋相互作用促进了蛋白质聚集。经过冻融循环后，由于冰晶重结晶的机械损伤，面筋网络中的孔隙数量和尺寸均增加。
3.5. 游离巯基分析
游离巯基(SHfree)含量反映了二硫键的水平。在冻融过程中，由于蛋白质展开和重折叠导致二硫键断裂，SHfree含量增加。补充DKGM减轻了这种增加。与KGM组相比，DKGM的添加减弱了冻融过程中面筋、谷蛋白和醇溶蛋白的SHfree含量增加。谷蛋白的SHfree含量高于醇溶蛋白，这主要源于它们不同的结构特征。然而，冻融对谷蛋白的影响比醇溶蛋白更显著，因为谷蛋白的SHfree含量增加率更高。这可能是因为醇溶蛋白能更有效地束缚水，从而减少冰晶造成的机械损伤。二硫键类型的差异也导致了这一现象：谷蛋白由链内和链间二硫键稳定，而醇溶蛋白由于其球形结构仅包含链内二硫键，链间二硫键更容易断裂。
3.6. 非共价键分析
非共价作用力（离子键、氢键、疏水相互作用）的分析表明，离子键和疏水相互作用是蛋白质中主要的非共价力。面筋蛋白组分的共价和非共价相互作用比例不同。谷蛋白含有较高水平的氢键和离子键，而醇溶蛋白则表现出更大比例的疏水相互作用。这是因为谷蛋白中的极性氨基酸残基更多地暴露在表面，从而易于与周围分子形成氢键和离子键；而醇溶蛋白中的大多数极性基团埋藏在分子内部，导致疏水区域占主导。
随着冻融循环的延长，面筋、谷蛋白和醇溶蛋白的非共价键表现出相似的趋势：离子键和氢键的比例下降，而疏水相互作用的比例增加。疏水相互作用在冻融过程中的增加趋势归因于疏水基团的暴露，这些基团通过疏水相互作用发生聚集，表明蛋白质变性并逐渐丧失功能。
作为一种中性多糖，DKGM可能在蛋白质分子之间形成物理屏障，从而减少极性相互作用，进而降低离子键水平。此外，DKGM的羟基竞争极性位点，形成氢键并显著增加其比例。经过3次冻融循环后，DKGM组比KGM组表现出更高比例的离子键和氢键，但疏水相互作用更低。这表明DKGM的空间位阻减小，有利于形成更稳定的多糖-蛋白质复合物，并在冻融过程中保护蛋白质结构。然而，高DD的DKGM分子容易聚集，从而增加蛋白质分子之间的距离，减少蛋白质间化学相互作用的形成。
3.7. 傅里叶变换红外光谱分析
样品的FTIR光谱表明，添加不同DD的DKGM略微改变了蛋白质的特征吸收峰，但未产生新的谱带。与对照组相比，DKGM导致吸收峰发生轻微的蓝移，并且这种趋势在冻融循环下持续存在。3280 cm?1附近的吸收峰位移与DKGM中羟基与蛋白质中氨基和羧基形成氢键有关。2930 cm?1附近的峰变化可能反映了蛋白质微环境改变对C-H伸缩振动的影响。1635 cm?1附近的位移与蛋白质二级结构的改变导致峰位移相关。1520 cm?1附近的峰位移可能是由于DKGM与蛋白质C-N或N-H基团之间形成氢键所致。
对冷冻面筋、谷蛋白和醇溶蛋白二级结构的分析显示，α-螺旋和无规卷曲是主要的二级结构，β-折叠含量相对较低。醇溶蛋白的α-螺旋含量高于谷蛋白。经过3次冻融循环后，所有组的α-螺旋含量下降，β-折叠和无规卷曲含量增加，β-转角含量基本不变。这表明冻融促进了α-螺旋向β-折叠和无规卷曲的转化，从而增加了蛋白质网络的无序性。DK2和DK3分别在缓解谷蛋白和醇溶蛋白的α-螺旋损失方面最为有效。这种差异可能与蛋白质结构有关：谷蛋白是一种刚性的线性蛋白质，易于形成坚固的网络，但高DD的DKGM容易聚集，因此在蛋白质网络内分散较差；而醇溶蛋白是一种结构松散的球状蛋白质，允许其与DK3更好地相互作用。
3.8. 分子量分布
对不同分子量范围内的主要蛋白质亚基进行分析发现，在所有样品中，蛋白质条带的数量和位置基本不变，表明DKGM的添加并未改变蛋白质亚基的组成或产生新的亚基。经过3次冻融循环后，高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)的条带灰度强度降低，而位于低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)区域的条带强度增加，表明面筋发生解聚。这种解聚主要归因于谷蛋白亚基间二硫键的破坏以及谷蛋白与醇溶蛋白亚基间非共价相互作用的破坏。随着DKGM的添加，条带灰度强度的变化率降低，表明DKGM有效保护了面筋蛋白内部的二硫键和非共价键。同时，在冻融3周期后观察到ω-醇溶蛋白的条带灰度强度显著增加。KGM组的增加率最低，可能源于其强水合能力协同增强了醇溶蛋白的水合作用并减轻了其聚集。相比之下，在DKGM组中，增加率随着DD的增加而下降，可能是因为减少的空间位阻使得DKGM能够更有效地分散在结构松散的球形醇溶蛋白中并促进相互作用。
3.9. 分子对接
分子对接的结合能反映了配体与受体之间的相互作用强度。结果显示，不同DD的DKGM与面筋蛋白组分均表现出良好的结合。参与这些相互作用的氨基酸在不同DD间相似，主要是谷蛋白中的Arg、Glu、Gln和Ser。这些氨基酸是亲水性的，易于与周围水分子形成氢键。DKGM可能通过氢键与这些残基相互作用，从而在冻融过程中稳定面筋蛋白的氢键网络和构象。中等DD的DKGM与谷蛋白显示出最强的结合亲和力，结合能为-6.3 kcal/mol。相比之下，高DD的DKGM倾向于自聚集，且残基的分散分布削弱了其与谷蛋白的结合亲和力。同时，DKGM通过Glu和Gln与醇溶蛋白结合。醇溶蛋白中Glu和Gln残基的密集分布使得高DD的DKGM能够形成更紧密的相互作用。
3.10. 示意图模型
示意图模型总结了DKGM对冷冻面筋蛋白及其组分的影响。实验结果表明，面筋蛋白在冻融循环中经历了一个“解聚-聚集”过程。首先，二硫键的破坏导致HMW-GS解聚。随后，谷蛋白的疏水基团暴露，低分子量面筋蛋白含量增加。这些蛋白质随后通过疏水相互作用发生聚集，在谷蛋白链上表现为聚集状态。这些结果突显了冻融过程中面筋结构变化的复杂性。
DKGM似乎主要通过与亲水性氨基酸建立氢键来形成稳定的复合物。这减轻了离子键、氢键和二硫键的断裂，并抑制了过度的疏水相互作用，从而延缓了冻融过程中的结构劣变。不同DD的DKGM对面筋蛋白及其组分的影响各不相同。由于KGM和DK1的高粘度，形成了面筋间二硫键受到限制。DK3固有的聚集倾向降低了其在更刚性的谷蛋白中的冷冻保护效果。相比之下，DK2具有中等的水结合能力和粒径，这可能使DKGM能够均匀分散在面筋网络中，并有效增强谷蛋白的冷冻稳定性。谷蛋白更容易受到冷冻诱导的结构破坏。DK2对面筋蛋白表现出最佳的整体冷冻保护性能。
结论与意义
本研究系统探讨了不同脱乙酰度DKGM对冷冻面筋及其组分结构的影响。与KGM相比，DKGM能更有效地稳定面筋蛋白的二级和三级结构，并减轻冻融循环中的结构劣变。这种增强的稳定性主要归因于DKGM促进了二硫键和α-螺旋的形成，并加强了面筋网络内的非共价相互作用。对谷蛋白和醇溶蛋白的分析表明，谷蛋白更容易受到冻融诱导的结构破坏，且DKGM主要通过增强谷蛋白的结构完整性来提高面筋的冷冻稳定性。中等脱乙酰度(50.21%)的DKGM表现出最显著的冷冻保护效果，这可能是因为它能与谷蛋白紧密结合，形成更稳定的多糖-蛋白质复合物。总之，这些发现为DKGM在冷冻面团体系中的冷冻保护作用提供了新的机理见解，并凸显了其在冷冻食品保鲜中更广泛应用的潜力。未来的研究应侧重于阐明DKGM对冷冻面筋中水分子流动性的影响，并采用分子模拟方法进一步阐明潜在的相互作用机制。
