《Food Chemistry: X》：Effects of endogenous walnut pellicle polyphenols on the structure and functional properties of walnut meal isolate proteins
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本研究针对核桃粕中内源性多酚与蛋白相互作用机制不清的问题，通过对比带种皮、去皮及脱酚处理的核桃蛋白，系统阐明了核桃种皮多酚通过氢键和π相互作用诱导蛋白结构展开与聚集，进而显著提升其持水性（WHC从1.72增至2.48 g/g）和起泡特性（FC和FS分别提高31.12%和46.44%），但降低表面疏水性（H0下降62.9%）、乳化活性及溶解度的规律。研究为核桃蛋白在特定食品体系中的应用提供了理论依据。
核桃（Juglans regia L.）作为重要的经济树种，其果实富含不饱和脂肪酸、蛋白质及多种生物活性成分，具有很高的营养价值和健康益处。核桃粕是核桃榨油后的主要副产物，蛋白质含量高达40-50%，是一种廉价的植物蛋白资源。然而，核桃粕目前多被用作动物饲料或直接丢弃，造成了资源的巨大浪费。随着食品工业对植物蛋白需求的快速增长，开发高附加值的核桃蛋白产品具有重要意义。核桃蛋白分离物通常采用碱提酸沉法从核桃粕中制备，但在此过程中，蛋白质与内源性多酚类物质的相互作用不可避免，这会显著影响蛋白的结构和功能特性，进而影响其应用潜力。因此，厘清核桃种皮多酚与核桃蛋白分离物之间的相互作用机制，对于指导核桃粕的高值化利用和核桃蛋白产品的开发至关重要。
以往的研究多采用外源添加或纯化后回加单一酚类物质的方式来研究蛋白-多酚相互作用，这与核桃粕实际加工过程中内源性多酚与蛋白的天然共存状态存在差异。核桃种皮是多酚的主要富集部位，其在核桃榨油过程中会混入核桃粕，从而在后续蛋白提取过程中与蛋白发生复杂的相互作用。这种在真实加工条件下的相互作用模式、对蛋白结构的具体影响机制以及最终如何调控蛋白的功能性质，目前尚不清晰。为了解决这一问题，西南林业大学生物与食品工程学院的曹云华、邓燕梅等研究人员在《Food Chemistry: X》上发表了一项研究，旨在系统探讨内源性核桃种皮多酚对核桃蛋白分离物结构和功能特性的影响。
为开展本研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术方法：首先，通过物理去皮和乙醇超声辅助提取相结合的方法，制备了未去皮核桃粕、去皮核桃粕和脱酚核桃粕三种原料。接着，采用碱提酸沉法从这三种核桃粕中分别提取出相应的核桃蛋白分离物。然后，利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析蛋白二级结构变化，紫外-可见光谱（UV-Vis）和内源荧光光谱监测蛋白构象变化及多酚-蛋白相互作用，差示扫描量热法（DSC）评估蛋白热稳定性。此外，还系统测定了蛋白的表面疏水性（H0）、溶解度、持水性（WHC）、持油性（OHC）、起泡性（FC/FS）及乳化性（EAI/ESI）等功能指标。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和扫描电子显微镜（SEM）观察蛋白分子量分布和微观结构。最后，采用分子对接模拟预测了代表性多酚小分子与核桃主要贮藏蛋白（7S和11S球蛋白）之间的结合模式和相互作用力。
3.1. 核桃蛋白分离物的基本组成
研究人员首先分析了三种核桃蛋白分离物的基本化学成分。结果表明，未去皮核桃蛋白分离物（UWalPI）的多酚含量最高，达到19.64 mg GAE/g，显著高于脱酚核桃蛋白分离物（DWalPI，9.50 mg GAE/g）和去皮核桃蛋白分离物（PWalPI，1.14 mg GAE/g）。这说明核桃种皮是UWalPI中多酚化合物的主要来源。去皮处理使PWalPI的多酚含量降低了94.19%。尽管乙醇脱酚处理使DWalPI的多酚含量降低了50.5%，但其残留酚含量仍显著高于PWalPI，这可能是由于部分多酚与蛋白质或细胞壁基质紧密结合，难以被乙醇完全提取。在蛋白含量方面，PWalPI最高（90.12%），而UWalPI（85.78%）和DWalPI（83.99%）较低，暗示多酚-蛋白复合物的形成或脱酚过程中的蛋白损失。DWalPI的含水量最高（4.97%），可能与脱酚处理引起的蛋白网络结构变化增强水结合能力有关。
3.2. FTIR分析
FTIR光谱显示，三种WalPI样品均具有典型的蛋白质红外吸收峰。通过酰胺I带的峰拟合分析二级结构发现，PWalPI以β-折叠结构为主，这与典型的种子贮藏球蛋白特征一致。相比之下，UWalPI的β-折叠含量减少，α-螺旋、β-转角和无规卷曲含量增加，表明多酚结合诱导了蛋白的部分去折叠和构象松弛。这种结构转变源于多酚酚羟基与肽链骨架羰基氧原子形成氢键，竞争并破坏了稳定β-折叠结构的分子内氢键。DWalPI的二级结构介于PWalPI和UWalPI之间，说明脱酚处理部分逆转了多酚诱导的结构变化，但未能完全恢复其天然构象。
3.3. 紫外-可见光谱与内源荧光光谱分析
UV-Vis光谱显示，UWalPI在280 nm等处有额外的吸收特征，这与多酚芳香环的吸收重叠有关。DWalPI在280 nm处的吸收峰低于PWalPI，可能由于残留多酚与蛋白紧密结合或嵌入蛋白聚集体，产生了褪色效应和增强的光散射。内源荧光光谱表明，PWalPI的荧光强度最高，最大发射波长为336 nm。UWalPI和DWalPI的荧光强度均降低（UWalPI降低51.3%），且发生蓝移，表明多酚结合引起了荧光猝灭，并改变了色氨酸和酪氨酸残基的微环境极性，使其疏水性降低，这与表面疏水性下降的结果一致。
3.4. 热稳定性分析
差示扫描量热法结果显示，PWalPI的峰值变性温度（Tp）最高（89.97 °C），UWalPI次之（85.95 °C），DWalPI最低（82.81 °C）。然而，DWalPI的变性焓变绝对值（|ΔH|，36.19 J/g）高于UWalPI（17.79 J/g）和PWalPI（16.28 J/g），表明尽管DWalPI变性温度较低，但其去折叠/变性过程需要更多能量。这说明多酚通过氢键、疏水相互作用等非共价作用与蛋白结合，改变了蛋白的空间构象和分子间聚集状态，从而影响了其热稳定性。此外，超声辅助脱酚过程也可能导致蛋白部分去折叠。
3.5. 表面疏水性与溶解度分析
表面疏水性（H0）分析表明，UWalPI的H0比PWalPI降低了62.9%，DWalPI降低了40.1%。多酚的引入增加了蛋白表面的亲水性，并通过空间位阻效应屏蔽了内部的疏水区域，导致H0降低。溶解度测定显示，PWalPI的溶解度最高（4.86%），UWalPI最低（2.36%），降低了51.4%。溶解度下降的主要原因是多酚（尤其是高分子量单宁）作为分子桥，与多个蛋白分子位点发生强非共价或共价交联，形成不溶性蛋白-多酚聚集体。
3.6. 持水性、持油性、起泡性及乳化性分析
功能特性测定揭示了多酚影响的复杂性。UWalPI的持水性（WHC, 2.48 g/g）最高，显著高于PWalPI（1.72 g/g）。这归因于多酚引入的亲水羟基和形成的氢键网络增强了水合作用。相反，UWalPI的持油性（OHC, 2.44 g/g）低于PWalPI（3.86 g/g），因为表面亲水性增加和疏水区域被屏蔽削弱了其与油的结合能力。在起泡性方面，UWalPI的起泡能力（FC, 121.24%）和泡沫稳定性（FS, 91.77%）均优于PWalPI（FC 90.12%, FS 45.33%）。多酚通过促进蛋白在气-液界面形成更厚、更坚固的吸附膜，并增加体系粘度，从而稳定泡沫。然而，在乳化性方面，PWalPI的乳化活性指数（EAI, 251.39 m2/g）和乳液稳定性指数（ESI, 56.58 min）均显著高于UWalPI（EAI 152.64 m2/g, ESI 34.51 min）。PWalPI更高的结构灵活性、溶解度和表面疏水性有利于其在油-水界面快速吸附和铺展，形成稳定的乳液。而UWalPI因多酚引起的交联和聚集降低了其柔性，并屏蔽了疏水区域，损害了乳化性能。
3.7. 总巯基与游离巯基含量分析
UWalPI和DWalPI的总巯基（T-SH）和游离巯基（F-SH）含量均高于PWalPI。这表明多酚的抗氧化作用抑制了巯基氧化为二硫键，同时多酚结合诱导的蛋白去折叠使原本包埋的巯基更易暴露，从而在检测中表现出更高的巯基含量。
3.8. SDS-PAGE与扫描电镜分析
SDS-PAGE显示UWalPI和DWalPI在凝胶顶部有更深的条带，表明存在高分子量蛋白聚集体，且这种聚集可能涉及共价交联。扫描电镜观察发现，UWalPI呈现明显的团聚块状结构，表面松散多孔；PWalPI主要为片状结构，边缘完整，分散性好；DWalPI则呈现边缘破裂的层状结构。这直观地反映了多酚诱导的蛋白聚集和形态变化。
3.9. 分子对接分析
分子对接模拟选取了柯里拉京、6-O-咖啡酰-D-葡萄糖和二羟基苯乙酮三种多酚小分子作为配体，与核桃7S球蛋白和11S球蛋白进行对接。结果显示，这些配体能够成功嵌入目标蛋白的活性位点，结合自由能（ΔG）在-5.2至-8.8 kcal/mol之间，表明结合亲和力为中等至较强。多酚与蛋白之间主要通过氢键以及π-阳离子、π-阴离子、π-烷基等π型相互作用结合。关键的极性氨基酸残基（如SER129, GLN401, ASN240等）和疏水/芳香族残基（如PRO100, ILE403, ARG270等）参与了这些相互作用，稳定了复合物，并可能调节局部蛋白的柔性。
本研究系统阐明了在真实加工条件下，内源性核桃种皮多酚通过氢键、π型非共价相互作用以及可能的醌介导的共价键与核桃蛋白分离物相互作用，诱导蛋白二级结构部分去折叠和三级结构松弛，促进蛋白聚集。这些结构变化导致蛋白溶解度、表面疏水性、持油性、乳化特性及热稳定性降低，但同时显著增强了其持水性、起泡能力和泡沫稳定性。分子对接结果从分子层面揭示了多酚与蛋白结合的可能模式和位点。研究结论表明，通过选择性调控核桃粕中的多酚含量，可以定制化地获得具有不同功能特性的核桃蛋白产品：富含多酚的UWalPI更适合用于需要高持水性和起泡性的食品体系，如膨化烘焙食品和充气饮料；而去皮或脱酚处理的WalPI则因其高溶解度和乳化活性，更适用于乳液体系和高蛋白饮料。该研究为核桃粕的高值化利用和核桃蛋白在功能性食品中的精准应用提供了重要的理论和实践依据。
