死后γ-羟基丁酸（GHB）形成的谜团——用于检测内源性GHB及其相关化合物的方法开发与验证

《Forensic Science International》：The mystery of post-mortem Gamma-Hydroxybutyrate formation - method development and validation for the detection of endogenous GHB and its related compounds

γ-羟丁酸（GHB）尸后浓度增高的机制尚不明确，本研究开发并验证了LC-MS/MS方法，可同步定量检测GHB、γ-丁内酯（GBL）及其代谢相关内源性物质（如琥珀酰半醛、γ-氨基丁酸等）。该方法通过固相萃取和优化色谱分离条件，实现0.5μg/mL检测限，并成功区分GHB同分异构体。该技术为阐明尸后GHB生物转化机制及区分内源性/外源性提供了新工具。

　　

Jana Kietzerow | Mario Thevis | Hilke Andresen-Streichert

科隆大学医学院及大学医院法医学研究所法医毒理学系，德国科隆Melatenguertel 60/62，50823

摘要

由于死后体内和取样后体外都可能形成γ-羟基丁酸（GHB），因此解读尸检样本中的GHB浓度仍然具有挑战性。代谢相关的内源性物质对死后GHB水平的可能影响尚未明确。为了解决这一问题，我们开发并验证了一种分析方法，可以同时检测GHB、γ-丁内酯（GBL）以及八种相关的内源性化合物：琥珀酸半醛、γ-氨基丁酸、腐胺、α-羟基丁酸（AHB）、β-羟基丁酸（BHB）、L-谷氨酸、琥珀酸和GHB-葡萄糖醛酸苷（GHB-Gluc）。样品制备包括使用乙腈/甲醇（85:15）进行蛋白质沉淀，然后进行固相萃取。色谱分离采用反相C-18分析柱，在33分钟内通过含有0.1%甲酸的水和乙腈作为流动相进行梯度洗脱。人全血作为校准和质控的基质，内源性水平通过基质空白样进行校正。该方法对所有分析物的检测限和定量限均达到0.5 μg/mL。校准范围根据化合物的不同可达到75 μg/mL。除了BHB、GHB、腐胺和琥珀酸外，大多数分析物均适用线性回归。准确性和精密度在整个浓度范围内均令人满意（< +/- 10%）。LC-MS/MS方法能够全面定量GHB及其死后增加过程中可能涉及的相关内源性物质。将该方法应用于实际尸检样本将有助于阐明这些化合物在死后GHB形成中的作用，并支持更准确的法医毒理学结果解读。

引言

内源性神经递质γ-羟基丁酸（GHB）存在于多种体液和组织中[1]。临床上，它被用作静脉麻醉剂[2]。由于其镇静作用，GHB也被滥用为所谓的“约会强奸”药物和娱乐性滥用物质[3]。由于GHB在体内自然存在，区分其内源性水平和外源性摄入尤为困难。即使在没有生前摄入的情况下，生物样本中GHB浓度的解读也因报告的死后显著升高而变得更加复杂[4]。影响这种升高的因素包括：死后间隔时间（PMI）；尸体或生物样本的储存时间和条件；以及采血部位（中心还是外周）[5]、[6]、[7]、[8]。迄今为止，死后GHB形成的机制尚未得到充分阐明。一种理论认为，在克雷布斯循环停止后仍活跃的酶通过琥珀酸半醛（SSA）将琥珀酸和GABA/腐胺转化为GHB[9]。此外，微生物的参与也被认为是死后GHB形成的潜在来源[7]、[10]、[11]。某些细菌能够将葡萄糖转化为琥珀酸，后者随后可能通过SSA转化为GHB[11]。为了区分外源性GHB摄入和内源性产生，或寻找延长检测窗口的方法，研究人员研究了多种GHB代谢的潜在生物标志物。这些标志物包括2,4-羟基丁酸、3,4-羟基丁酸、琥珀酸[12]、[13]、GHB异构体α-羟基丁酸（AHB）和β-羟基丁酸（BHB）[14]、[15]，以及GHB-葡萄糖醛酸苷（GHB-Gluc）[16]、[17]。Küting等人的研究表明，2,4-羟基丁酸和SSA作为延长GHB检测窗口的潜在生物标志物效果有限。而3,4-羟基丁酸则显示出潜力[12]。Shima等人和Jarsiah等人报告称，琥珀酸不是可靠的GHB摄入生物标志物[13]、[14]。Shima等人还强调了色谱分离GHB异构体AHB和BHB的重要性，因为它们的质谱图非常相似[14]。此外，GHB-葡萄糖醛酸苷似乎也不适合用于延长GHB的检测窗口[16]。

本研究的目的是开发并验证一种分析方法，以定量十种选定的内源性化合物：L-谷氨酸、BHB、腐胺、琥珀酸、AHB、γ-氨基丁酸（GABA）、γ-丁内酯（GBL）、GHB-Gluc和SSA（图1），从而识别可能参与死后内源性GHB形成的分析物。

方法开发

化学试剂

Ultra-LC MS级乙腈、LC-MS级甲醇、腐胺和L-谷氨酸购自Carl Roth（德国卡尔斯鲁厄）。HPLC-LC MS级水购自VWR（美国Radnor）。ULC/MS级甲酸（超低杂质/质谱级）购自Biosolve Chimie（法国Dieuze）。GHB钠盐（γ-羟基丁酸）、γ-氨基丁酸（GABA）、γ-氨基丁酸-D₆（GABA-D₆）、α-羟基丁酸（AHB）、β-羟基丁酸（BHB）、L-谷氨酸¹³C_5,¹⁵N

方法开发

共测试了六种不同的色谱柱，并使用了多种流动相和梯度条件（见补充表2）。在某些情况下，没有实现分析物的保留（在空白体积中洗脱）和/或分离不足——尤其是AHB、BHB和GHB。此外，在某些情况下还观察到非常宽的峰形。

对分析柱和流动相的评估表明，只有Waters Atlantis^TM Premier BEH C18 AX VanGuard^TM FIT柱满足要求

方法开发

在方法开发过程中遇到了几个挑战。所有目标分析物都是结构相似的小分子，并且在人体内内源性存在，这使得方法开发、验证和分析特别困难，原因之一是缺乏真正的空白基质。特别是GHB异构体的色谱分离在保留时间方面带来了额外的挑战。提取程序进行了优化

结论

所建立的方法能够可靠地定量GHB及其代谢途径中的九种其他分析物，所有这些分析物都可以在一次分析运行和一次提取过程中完成。据我们所知，这是首次能够同时定量这一特定代谢物组的方法。作为下一步，该方法将应用于更大的尸检样本队列，以研究这些分析物是否在死后体内GHB的产生中起作用

伦理批准

已获得汉堡医学协会伦理委员会的批准（伦理批准编号：PV 5889）。

关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

作者声明在写作过程中没有使用生成式AI和AI辅助技术。

资金支持

本研究未获得公共部门、商业部门或非营利部门的任何特定资助。

CRediT作者贡献声明

Hilke Andresen-Streichert：撰写——审稿与编辑、监督、概念构思。Jana Kietzerow：撰写——初稿撰写、验证、方法学研究、数据分析、数据整理、概念构思。Mario Thevis：撰写——审稿与编辑、监督。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢Phenomenex、Waters和Macherey-Nagel提供的技术支持。同时感谢Dr. June Mercer-Chalmers-Bender对英文稿件的细致和专业修订。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。