《Horticultural Plant Journal》：Epigenetic regulation of fruit anthocyanin biosynthesis in horticultural crops
编辑推荐：
本综述系统阐述了园艺作物花青素生物合成的表观遗传调控机制，涵盖DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA（miRNA, lncRNA）等层面。文章归纳了MBW复合物（MYB/bHLH/WD40）的核心作用，并探讨了表观遗传编辑技术（如CRISPR/dCas9）在作物育种中的应用前景，为提升果实品质和色泽提供了新的研究视角和育种策略。
花青素是植物中主要的水溶性色素，它不仅赋予园艺植物丰富的色彩和营养价值，更是决定果实品质和商业价值的关键因素。在过去的几十年里，表观遗传修饰被证明显著影响花青素的积累及其对环境信号的响应。近年来，群体水平上的表观遗传调控已成为日益重要的研究焦点。
1. 引言
果实颜色是园艺物种重要的品质决定因子。花青素作为水果中主要的水溶性色素之一，对果实的着色和品质贡献显著。花青素不仅能赋予果实鲜艳的色彩，还具有多种生理效应，如抗氧化特性和对健康的益处，包括激活机体内在的抗氧化保护系统、发挥抗炎作用，以及对心血管疾病和癌症的保护作用。因此，花青素的研究吸引了消费者和研究人员的广泛关注。特别是参与园艺作物花青素生物合成调控网络的基因，已作为育种计划中的靶标基因而备受关注。
近年来，花青素积累的调控机制已被深入探索。研究逐渐揭示了核心结构基因（如PAL、CHS、ANS）的功能以及控制花青素积累的转录调控机制。由MYB、bHLH和WD40组成的MBW复合物协同控制花青素生物合成结构基因的表达。其中，MYB在调控花青素生物合成中的作用被广泛研究，特别是MYB10，其在草莓、海棠、桃等多种植物物种的花青素合成中显示出保守的功能。除了上述转录因子，其他转录因子如bZIP转录因子HY5、ERF转录因子ERF109、WRKY转录因子MdWRKY10等也参与调控花青素的积累。
此外，越来越多的证据强调了表观遗传修饰在微调由环境信号触发的色素生物合成中的关键作用，它作为一个动态的调控层来调控花青素的积累。表观遗传调控包括多种分子机制，如DNA甲基化、组蛋白修饰和变异、非编码RNA、RNA修饰和染色质重塑。表观遗传机制通过调节染色质结构和转录调控来调控基因表达，而不依赖于DNA序列的改变。总体而言，积累的证据表明表观遗传修饰调控花青素的生物合成，彰显了表观遗传学的关键作用。
2. 通过DNA甲基化调控园艺植物花青素生物合成
DNA甲基化发生在胞嘧啶的CHH、CG、CHG（H代表A/T/C）基序上。这种DNA修饰与基因组稳定性、基因表达控制（通常导致转录失活）以及作为独立于序列变异的发育调控的关键决定因子有关。在此背景下，DNA甲基化标记的沉积、保存和去除受到多种酶活性的动态调控。特别是，RNA导向的DNA甲基化（RdDM）途径通过DOMAIN REARRANGED METHYLTRANSFERASES (DRM1/2)的催化活性负责DNA的de novo甲基化。反过来，为了维持DNA甲基化，CG甲基化由DNA METHYLTRANSFERASE 1 (MET1)维持，CHG甲基化通过植物特异的CHROMOMETHYLASE 3 (CMT3)维持，而CHH甲基化可以通过两种酶：CMT2和DRM2来维持。另一方面，植物的DNA去甲基化涉及四种去甲基化酶：DME、ROS1、DML2和DML3。
积累的证据表明DNA甲基化显著影响园艺作物中的花青素生物合成。在苹果中，RdDM途径中的MdAGO4与MdMYB1启动子相互作用，并与MdRDM1/2形成效应复合物来调节CHH甲基化和花青素积累。MYB10启动子中的高甲基化诱导MYB10的转录沉默，从而降低苹果果皮中的花青素积累。研究还发现，参与花青素生物合成的基因以及MYB/bHLH转录因子的DNA甲基化状态与苹果果皮颜色相关。随后，证明MYB转录因子MdLUX/MdPCL-like通过结合MdF3H启动子并随后进行转录激活来促进花青素产生，并且其启动子区域的mCG甲基化与基因表达和花青素生物合成呈负相关。同年，发现MdMYB90-LIKE是增强富士苹果红色芽变突变体着色的关键正调控基因。值得注意的是，在肤色突变体中，MdMYB90-like启动子特定区域（–1 183 ～ –988 bp, –2 018 ～ –1 778 bp）的DNA甲基化水平显著降低。这种低甲基化可能是观察到的MdMYB90-like表达上调和随之而来的花青素积累的原因。发现MdROS1通过降低其启动子的甲基化水平来上调核心花青素生物合成基因（包括MdCHS、MdCHI、MdF3′H等）的表达，从而影响花青素生物合成途径，最终增加低温条件下苹果中花青素的积累。在‘代红’苹果果实发育过程中，由于胞嘧啶甲基化水平以及基因和转座因子5'和3'侧翼区域甲基化的增加，花青素含量逐渐降低。推测这与DNA去甲基化酶基因（如MdDME1, MdROS1/2）表达减少有关。
除了苹果，越来越多关于其他园艺植物的研究强调了DNA甲基化在调控花青素生物合成中的作用。据报道，PcMYB10的甲基化水平与梨果实肤色相关。同样，研究人员构建了梨果肉代谢的关联数据库，发现果实发育过程中DNA甲基化增加；进一步探讨了DNA甲基化抑制剂的效果，鉴定出PbZFP1与ABA生物合成相关，并提出DNA甲基化抑制ABA积累，可能延迟果实成熟。类似地，在葡萄中，DNA甲基化影响花青素生物合成，用玉米核苷（一种DNA甲基化抑制剂）处理可增强花青素产生，并与花青素生物合成所必需的UFGT基因的甲基化降低相关。转色期的DNA甲基化水平相对高于绿色和成熟期果实；此外，逆转录转座子3' LTR区域DNA甲基化的降低与葡萄中花青素的生物合成相关。另外，有研究报告了DNA甲基化在葡萄浆果肤色中潜在的调控功能。DNA甲基转移酶基因，特别是VvMET2b、VvMET3、VvCMT2b和VvCMT3的表达在肤色形成期间增加，修饰类黄酮及相关途径中的DNA甲基化，进而影响它们的表达并调控花青素积累，从而确保在整个发育阶段S1到S3的正常果皮着色。在另一个案例中，FcUFGT3启动子的低甲基化水平对于无花果果实成熟和颜色转变过程中花青素积累的调控至关重要。一致地，在甜橙果实中，DML1可能在决定观察到的DFR和Ruby启动子去甲基化中起关键作用，并且其表达在果实高色素沉着区域受低温诱导。此外，花青素生物合成相关基因启动子（PpPALs、PpC4H、Pp4CLs等）中较低的甲基化水平对于桃果实采后温度介导的花青素生物合成似乎至关重要。此外，对猕猴桃的研究发现了一个关键基因GST，它正向调控花青素积累，其启动子低甲基化增强了外果皮内的花青素生物合成。白色果肉萝卜突变体是由甲基化从超甲基化的CACTA转座子扩展到RsMYB1启动子而产生的，并且PrANS/PrF3H启动子的高甲基化水平可能是介导PrF3H/PrANS在Paeonia rockii非斑块色素沉着中沉默的主要调控机制。另外，CmMYB6通过可遗传的去甲基化影响花青素积累，从而决定菊花的花色。总体而言，积累的实验证据清楚地表明，DNA甲基化在各种园艺植物的花青素生物合成中起着关键的调控作用。理解这些机制为改善这些物种的品质和开发新的育种策略提供了宝贵的见解。
3. 通过组蛋白修饰调控园艺植物花青素生物合成
目前的研究表明组蛋白修饰对花青素合成至关重要。染色质的基本重复单元是核小体，由组蛋白组成，DNA缠绕其上，组蛋白是由H2A、H2B、H3和H4蛋白对组成的八聚体。组蛋白修饰发生在组蛋白八聚体的尾部，包括甲基化、乙酰化、磷酸化和糖基化。
依赖组蛋白甲基转移酶（HMTs），组蛋白甲基化修饰赖氨酸和精氨酸残基，主要集中于组蛋白H3赖氨酸甲基化修饰：H3K4、H3K9、H3K27和H3K36。特别是，H3K4和H3K36甲基化与活性染色质和基因激活相关，而H3K9和H3K27主要介导转录抑制。组蛋白赖氨酸残基的单甲基化、二甲基化和三甲基化可由组蛋白赖氨酸甲基转移酶（KMTs）催化，最近的研究表明组蛋白甲基化影响花青素合成。例如，在番茄中，特定的NF-YB和NF-YC亚基形成复合物结合CHS1的CCAAT元件。此外，抑制某些NF-YB基因会增加CHS1位点的H3K27me3丰度，降低CHS1表达和类黄酮积累，从而导致粉红色番茄具有无色果皮。黑暗诱导杨树中带有JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶JMJ25的表达。JMJ25靶向MYB182染色质区域去甲基化H3K9me2，从而促进MYB182的主动转录，进而在黑暗暴露期间抑制花青素和原花青素的积累。然而，在非园艺模型拟南芥中的研究揭示了JmjC去甲基化酶以尚未在水果作物中测试的方式微调花青素水平。在拟南芥中，带有JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶IBM1的增加有助于高光强度诱导的花青素积累。IBM1表达受高光强度上调，并且与SPA1/3/4基因直接相关，因为IBM1使其染色质去甲基化并解除转录抑制。此外，IBM1主要通过SPA1、SPA3和SPA4调控花青素生物合成途径中的转录因子和结构基因表达，从而抑制高光诱导的异常花青素积累。
组蛋白乙酰化也是一种重要的组蛋白修饰，作为转录调控、染色质重塑和mRNA水平的核心调节因子。与组蛋白甲基化修饰类似，组蛋白乙酰化发生在组蛋白H3和H4的赖氨酸残基上，并通过组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶的稳态进行调节。乙酰转移酶催化乙酰基（-COCH3）引入组蛋白赖氨酸残基，导致更松散的染色质结构，进而促进转录因子结合。组蛋白乙酰化也参与园艺植物的花青素合成。在梨中鉴定并表征了乙烯诱导的PpERF9转录因子。它作为转录抑制因子发挥作用，与PpRAP2.4和PpMYB114形成调控回路，并与PpTPL1相互作用以介导PpRAP2.4和PpMYB114的组蛋白去乙酰化，揭示了乙烯抑制梨花青素生物合成的机制。此外，最近的研究表明，VvHDAC19招募VvERF4到葡萄（Vitis vinifera）中已被证实调控花青素生物合成的VvMYB5a启动子区域。VvHDAC19协同抑制VvMYB5a转录水平，从而减少花青素合成。此外，VvHDAC19和VvERF4通过调节组蛋白H3和H4乙酰化水平来调控花青素积累。最近的研究表明，在亚洲杂交百合中，LhHB4作为花青素积累的抑制因子：一方面，它直接结合LhMYBSPLATTER启动子并抑制LhWRKY44的表达；另一方面，它与LhTPR3结合构成一个抑制复合物，降低了LhWRKY44和LhMYBSPLATTER启动子的组蛋白H3乙酰化水平，从而通过组蛋白乙酰化调控花青素积累。组蛋白乙酰化和去乙酰化过程是园艺植物花青素积累调控控制不可或缺的部分，特定的转录因子和酶在调节这些途径中发挥关键作用。这些为改变园艺作物的果实和花色提供了潜在的靶标。
4. 通过非编码RNA调控园艺植物花青素生物合成
非编码RNA（ncRNAs）被归类为不具有蛋白质编码功能的RNA。基于结构和大小标准，ncRNAs可以分为几个不同的类别，包括小干扰RNA（siRNA）、微RNA（miRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）。siRNA主要通过RNA干扰机制实现特定基因序列的沉默，miRNA通过抑制翻译或mRNA切割来调控靶基因的表达，而lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的非蛋白质编码RNA。这些各种形式的ncRNA已在众多物种中被检测到。ncRNAs对于基因表达的表观遗传调控至关重要，补充了其在转录和转录后调控机制中已有充分记载的功能。确实，越来越多的研究表明ncRNAs调控花青素生物合成途径。
关于microRNA调控花青素生物合成的研究一直强调miR156-SPL模块的核心作用，该模块作为整合环境和发育信号的关键整合器。其基本机制在拟南芥中建立，miR156正向调控花青素合成，其靶基因SPL9与PAP1竞争性相互作用，抑制MBW复合物的转录激活活性，从而影响花青素合成基因的表达。miR156也被证实与园艺作物（梨、荔枝、葡萄和茶）中的花青素生物合成有关。然而，不同物种具有不同的机制。同时，在茶中，Csn-miR156d通过转录抑制靶基因CsSPL1来促进花青素生物合成。在梨和荔枝等果树中，该模块与光反应过程有复杂的联系。此外，研究表明，当梨暴露于光照时，PyPIF5下调，其对PymiR156a表达的负调控减弱。这导致miR156的靶基因PySPL9被降解。进而消除了PySPL9对调控MYB复合物形成的干扰。在荔枝中，记载了miR156a与其靶基因LcSPL1/2的表达模式呈负相关。miR156a的上调引发LcSPL1转录水平的下降，后者通过与LcMYB1相互作用来抑制花青素积累。除了光，该途径介导干旱胁迫响应。在葡萄浆果中，发现干旱诱导的vv-miR156b与花青素含量和生物合成基因的增加相关。VvAREB2激活miR156b靶基因VvSBP8/13的表达，这些基因与VvMYC1/VvMYBA1相互作用，影响MBW复合物和花青素生物合成。总之，miRNA156调控的花青素网络在其他园艺物种中的作用及其上游转录激活子的身份仍有待阐明。
同时，在苹果中，miR172在多种组织类型中调控花青素生物合成。据推测，miR172通过抑制转录因子AP2来减少类黄酮的产生，而AP2反过来会激活MdMYB10。
在草莓中，miR399响应低磷胁迫，其靶基因FvPHO2负调控花青素含量。在海棠中，miR399d和McPHT1;4对于磷酸盐缺乏响应和增强花青素产生至关重要。沉默HDA6基因降低了MET1的表达水平和MYB10的甲基化水平，从而增加了MYB10的表达水平和花青素的积累。
miR828的过表达抑制了拟南芥中与花青素生物合成正调控相关的转录因子AtMYB75、AtMYB90和AtMYB113的表达。类似地，光诱导油菜幼苗中花青素积累并下调BrmiR828的表达，并增加BrmiR828靶基因BrTAS4、BrPAP1和MYB82的表达，正向调控花青素积累。进一步，mdm-miR828的过表达抑制花青素生物合成并受MdMYB1调控。此外，mdm-miR828参与苹果中花青素生物合成的反馈调控和高温响应抑制。相反，结果表明miR828可能通过其靶基因MYB12在马铃薯中促进花青素积累。一致地，研究表明，在葡萄中，miR828和miR858通过沉默MYB114（一种MYB抑制因子）来间接增强花青素积累。
miR858a通过抑制HY5（长下胚轴5）的负调控转录因子MYBL2，间接影响花青素生物合成基因的表达水平，从而增加拟南芥中的花青素浓度。但在猕猴桃中，miR858L具有长环发夹结构，并且miR858显著抑制猕猴桃叶片中的原花青素和类黄酮含量。在番茄中，miR858主要通过转基因番茄不同器官中SlMYB7-like的转录下调来抑制花青素生物合成。同样，MdHY5结合mdm-miR858启动子，从而抑制其转录。因此，这种抑制减轻了mdm-miR858介导的MdMYB9/MdMYBPA1降解，随后促进苹果中的花青素积累。
此外，在苹果中，光诱导MdMYB1的表达，其产物MdMYB1激活mdmiR7125表达，进而负调控MdCCR（木质素生物合成中的关键酶），从而降低木质素含量并促进苹果果皮中花青素的积累。
先前的研究也强调了lncRNAs在苹果果实花青素生物合成中的主要参与。鉴定了一个MdWRKY1–MdLNC499–MdERF109的转录级联，其中光激活的MdWRKY1激活MdLNC499表达。并且MdLNC499激活MdERF109以增强苹果果实着色初始阶段的光依赖性花青素积累。此外，发现高光条件通过诱导乙烯生物合成来刺激苹果中的花青素产生，并且MdLNC610作为MdACO1的转录激活因子，参与乙烯生物合成。虽然这些发现建立了lncRNAs与苹果花青素合成之间的明确联系，但需要进一步的研究来发现更多的lncRNAs。
5. 结论与展望
许多园艺植物，包括水果（如苹果、葡萄、草莓）、蔬菜（如紫甘蓝、茄子）和观赏植物（如矮牵牛、菊花），都富含花青素。花青素不仅决定颜色（从红色、紫色到蓝色），而且作为天然抗氧化剂具有生物活性特性。花青素参与植物的胁迫适应机制，例如抵消紫外线辐射、低温和干旱，以及防御病原体。此外，作为人类饮食的组成部分，它们具有有益健康的特性。
花青素的生物合成和调控是高度复杂的过程。近几十年来，在阐明花青素生物合成途径和探索其调控网络方面取得了显著进展。表观遗传修饰领域正在经历快速发展。表观遗传修饰也被证明影响参与花青素产生的基因的mRNA水平，从而调节花青素积累。在此，我们概述了当前关于园艺作物花青素调控的表观遗传修饰的研究。这些研究为在具有不同果实颜色的园艺植物育种中应用表观遗传修饰奠定了理论基础。
然而，关于园艺作物花青素积累的表观遗传调控的许多机制仍不清楚，需要进一步研究。当前园艺植物花青素合成的表观遗传研究主要集中在经典途径，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA。花青素的产生受到环境条件的强烈影响，包括光照、土壤养分和温度。这些环境因素通过表观遗传修饰调控花青素合成的机制目前有限。表观遗传多样性越来越被认为是增强植物适应环境变化的变异来源。
精确的表观遗传基因组工程旨在将染色质修饰组件靶向基因组上的特定位点，以调控基因表达而不改变其基因组序列。CRISPR/dCas9是一种高效的表观遗传研究工具，正在不断优化。此外，发现CG特异性DNA甲基转移酶MQ与ZF蛋白或CRISPR/dCas9结合可以诱导特异性DNA甲基化。最近的研究证明了SunTag-MQ1系统在拟南芥中成功实现miR157a甲基化。然而，将CRISPR/Cas9表观遗传工程应用于植物仍需要大量的研究。园艺植物中的表观遗传修饰和表观基因组工程有可能为未来的育种策略开辟新的途径。
总之，在提高园艺作物遗传转化效率的基础上，开发和利用植物特异性高效的表观遗传编辑系统以实现精确的表观遗传调控，例如靶向DNA甲基化或组蛋白修饰，以创造色泽优良、品质卓越的园艺植物新品种，仍然面临许多挑战。
