基于CRISPR相关转座酶的大肠杆菌基因插入与转录调控

《International Journal of Biological Macromolecules》：Gene insertion and transcriptional regulation of Escherichia coli based on CRISPR-associated transposases

合成生物学中，通过开发基于CRISPR相关转座酶（CAST）的MUSCULAR-CAST系统，实现了1-10 kb大polycistronic表达载体的高效基因组整合，构建了3-FL生产菌株（产量与质粒载体相当但生长更优）和切 Xin酶重组菌株（酶活性更高）。同时基于MUSCULAR-CAST靶向模块开发了Tn-CRISPRi转录调控工具，通过抑制mdoH和motA基因使3-FL产量分别提升2.79倍和4.4倍。研究建立了基因组整合与转录调控的通用工具，推动合成生物学底盘菌株工程发展。

　　

Jing Wu|Shengqi Gao|luyao Wang|Minglei Hou|Mengwei Zhang|Xuyang Zhu|Hui Luo|Xinrui Yu|Huihui Lv|Shumin Chen|Yan Huang|Kang Zhang

江南大学生物技术学院，中国无锡，214122

摘要

合成生物学旨在构建稳健的微生物细胞工厂，以实现可持续的生物制造。主要障碍在于难以高效地将大型多基因表达盒整合到基因组中，并灵活调节基因表达。在此，我们基于I型F CRISPR相关转座酶（CAST）系统Tn6677开发了一种可编程工具MUSCULAR-CAST。利用MUSCULAR-CAST，我们成功地将不同大小的多基因表达盒（1–10 kb）高效整合到基因组中。其中，构建了一种能够生产人类母乳寡糖3-岩藻糖（3-FL）的底盘菌株，其产量和生长性能均优于质粒表达菌株；同时，还构建了一种不含质粒的角质酶重组表达菌株，其酶活性高于含有质粒的菌株。此外，我们基于MUSCULAR-CAST的靶向模块开发了一种基因抑制工具Tn-CRISPRi，实现了对多种PAM序列的高效单基因抑制（98.6–99.8%）。应用Tn-CRISPRi抑制与3-FL生物合成竞争的17个基因或对生长非必需的基因后发现，敲低渗透调节的胞壁多糖生物合成蛋白H（mdoH）和运动蛋白A（motA）分别使3-FL产量增加了2.79倍和4.4倍。本研究证明了MUSCULAR-CAST和Tn-CRISPRi是基因组整合和转录调控的有效工具，为合成生物学中的高级底盘菌株工程提供了可扩展的框架。

引言

合成生物学利用微生物细胞工厂将可再生底物转化为有价值的产品，包括氨基酸、有机酸、维生素、功能性糖类、酶等，这已成为一门变革性学科，为能源可持续性、环境保护和医疗保健等紧迫问题提供了创新解决方案。为了提高合成生物学中底盘菌株的生产能力，开发先进的基因组编辑和调控工具至关重要。目前的方法主要依赖于CRISPR/Cas系统，这些系统通过精确的靶向性和可编程性彻底改变了生物工程。在基因组编辑过程中，Cas核酸酶引起的DNA断裂需要同源定向修复（HDR），这限制了同时进行多位点、大片段插入编辑的效率。这些技术障碍凸显了开发新的底盘菌株工程工具的迫切需求，这些工具能够实现高效的基因整合或精确的基因表达调控。

转座子元件已被证明是基因组的动态组成部分[1]，并且在所有主要系统发育分支中都检测到了它们的存在[2]。这类移动遗传元件通过驱动基因组结构重塑[4]、调节基因表达网络[5]以及促进遗传变异的积累[3]，深刻影响了物种的适应性进化过程。传统的转座子元件可以在没有同源修复系统辅助的情况下插入片段，但缺乏在特定目标位置插入的编程能力。近年来，通过结合CRISPR-Cas的可编程靶向性和转座子的DNA插入能力，出现了CRISPR相关转座酶（CAST）。著名的例子包括源自霍乱弧菌的I型F CAST（Tn6677）和源自Scytonema hofmanni的V型K CAST[6][7][8]。这些CAST的发现为新型基因组编辑（尤其是基因插入）和表达调控工具的开发奠定了基础。I型F CAST系统由Cascade（Cas6、Cas7、Cas8、crRNA）、TnsA、TnsB、TnsC和TniQ组成，采用“剪切和粘贴”机制进行基因插入；V型K CAST系统由Cas12k、crRNA、TnsB、TnsC和TniQ组成，通过“复制和粘贴”转座机制实现外源基因的基因组插入。V型K TnsC需要双链DNA的变形来形成稳定的螺旋纤维，这会导致脱靶插入；而I型F TnsC则无需DNA重塑即可组装ATP依赖性的七聚体环，其脱靶插入相对较少[9][10][11]。目前，I型F CAST系统被广泛采用。INsert Transposable Elements by Guide RNA-Assisted TargEting（INTEGRATE）系统及其衍生系统MUCICAT（利用CRISPR相关转座酶进行多拷贝染色体整合）为合成生物学中的基因插入提供了方便且可编程的工具[8][12]。INTEGRATE和MUCICAT已用于通过将目标途径表达盒插入基因组来构建微生物细胞工厂，从而降低了代谢压力，有利于目标生物合成[13][14]。

大肠杆菌因其遗传背景明确、繁殖迅速和基因操作简单[15][16][17]，被广泛用作合成生物学中的底盘菌株。减少大肠杆菌代谢底盘对质粒的依赖已成为工业生物合成的优先工程策略，通过消除质粒分离不稳定性以及与抗生素抗性标记和质粒复制相关的代谢负担，提高了遗传稳定性[18][19]。由于质粒在基因操作中的便利性和高效性，它们常用于模块化目标途径，不同模块由不同拷贝数的质粒携带。为了实现从基于质粒的模块化优化到稳定基因组整合的稳健过渡，我们旨在将这些大型多基因表达盒整合到多个基因组位点。我们还探索了利用CAST系统的靶向模块进行精细调控，进一步扩展了其在合成生物学中的应用。

在这项研究中，基于INTEGRATE和MUCICAT系统，我们开发了用于多基因位点插入大型多基因表达盒和多目标抑制的工具，并进一步优化以实现更广泛的应用。首先，我们对CAST元件的启动子进行了优化以提高编辑效率。为了防止自我靶向，将crRNA与目标基因共表达。通过将温度敏感的复制子和levansucrase基因整合到转座子传递质粒中，实现了对编辑起始和终止的进一步控制，从而实现了快速清除质粒。这种优化的系统被称为MUSCULAR-CAST（MUlti-Site CUt-burden, LARge-fragment genomic integration using CRISPR-ASsociated Transposases），能够在多个基因组位点高效、低负担地整合大型多基因表达盒。利用MUSCULAR-CAST，我们成功构建了生产3-岩藻糖（3-FL）、L-色氨酸和角质酶的底盘菌株。大小从1 kb到10 kb的多基因表达盒均成功整合到了基因组中，其中最复杂的包含七个酶基因。应用MUSCULAR-CAST构建的Thermobifida fusca（T. fusca）底盘菌株产生的3-FL和角质酶突变体C_4Mz的产量或酶活性与质粒表达的相当或更高。此外，基于MUSCULAR-CAST的靶向模块开发了转录抑制系统（Tn-CRISPRi），实现了低PAM依赖性的基因调控。通过调节crRNA和TniQ-Cascade（TniQ、Cas8、Cas6）的转录水平，Tn-CRISPRi几乎以100%的效率同时抑制了这两个位点，且对菌株生长影响很小。在测试Tn-CRISPRi在合成生物学中的应用时，我们发现当抑制渗透调节的胞壁多糖生物合成蛋白H（mdoH）和运动蛋白A（motA）时，3-FL产量分别增加了2.79倍和4.40倍。总之，MUSCULAR-CAST基因整合工具和Tn-CRISPRi转录抑制工具的构建和优化及其应用，为合成生物学中构建和优化高产底盘菌株提供了新的思路和方法。

部分内容片段

培养基和抗生素

Luria-Bertani（LB）培养基含有5 g/L酵母提取物、10 g/L色氨酸和10 g/L NaCl。Terrific Broth（TB）含有2 g/L酵母提取物、5 g/L (NH₄)₂SO₄、2 g/L KH₂PO₄、0.7 g/L MgSO₄·7H₂O、0.05 g/L FeSO₄·7H₂O、0.05 g/L MnSO₄·H₂O。发酵培养基（g/L）含有甘油30、KH₂PO₄ 6.725、MgSO₄·7H₂O 1.4、(NH₄)₂HPO₄ 2.0、C₆H₈O₇·H₂O 1.7、工业酵母提取物5、色氨酸2.5以及微量金属离子液体10 mL [FeSO₄·7H₂O 10.0、MnSO₄·4H₂O 0.5、(NH₄)₆Mo₇O₂₄ 0.1、CuSO₄·5H₂ 3.0]

在大肠杆菌中构建和测试MUSCULAR-CAST系统

合成生物学的核心在于底盘菌株的工程改造，主要是通过过表达目标代谢途径和敲除或抑制竞争途径。目标代谢途径通常涉及多个基因，研究人员通常将这些基因分类为功能模块并整合到具有不同拷贝数的质粒中。这些质粒上的基因通常位于多基因操纵子中。尽管质粒使用方便且应用广泛

结论

底盘菌株中的目标代谢途径通常涉及多个基因，这些基因的过表达通常会导致大型多基因模块的形成。由于不同模块通常需要不同的表达水平，因此通常使用多个质粒来进行传递。基于质粒的系统在底盘菌株工程中得到广泛应用，因为它们在基因操作方面简单且灵活。然而，过多的质粒可能会带来显著的

CRediT作者贡献声明

Jing Wu：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、研究、资金获取。Shengqi Gao：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、软件开发、方法学研究、数据分析、概念化。luyao Wang：验证。Minglei Hou：验证。Mengwei Zhang：验证。Xuyang Zhu：验证。Hui Luo：验证。Xinrui Yu：验证。Huihui Lv：验证。Shumin Chen：验证。Yan Huang：资源提供。Kang

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