基于氧化魔芋葡甘露聚糖/硫醇化壳聚糖/细菌纤维素的结肠靶向益生菌递送系统：提高存活率、增强黏膜黏附力并调节肠道微生物群

《International Journal of Biological Macromolecules》：Colon-targeted probiotic delivery system based on oxidized konjac glucomannan/thiolated chitosan/bacterial cellulose: Enhanced survival, mucoadhesion, and gut microbiota modulation

益生菌递送系统研究显示，采用氧化 konjac葡聚糖（OKGM）、硫代壳聚糖（sCS）和细菌纤维素（BC）构建的（sCS-BC）/OKGM-SA双乳液微球系统，通过离子交联技术实现胃酸稳定性及肠道pH-酶双响应释放，增强益生菌在结肠粘附和增殖能力，有效改善肠道菌群多样性与屏障功能。

任许宁|张文|刘敏申|葛吉翔|杨红|池桂林

陕西科技大学食品科学与工程学院，中国西安710021

摘要

益生菌在维持人体健康稳态方面起着关键作用，但由于其在胃肠道中的存活率低、释放不受控制以及靶向定植效率低下，口服给药面临诸多挑战。为了解决这些问题，我们采用W1/O/W2双乳液技术结合离子交联方法，使用氧化魔芋葡甘露聚糖（OKGM）、巯基化壳聚糖（sCS）和细菌纤维素（BC）制备了具有结肠靶向性的黏膜黏附性微球（sCS-BC）/OKGM-SA。体外消化实验表明，这些微球能够在模拟的胃酸和胆盐环境中有效保护益生菌，并在肠道中实现pH值和酶响应性的释放，使益生菌的存活浓度达到1.5×10^8 CFU/mL。流变学特性分析和体内胃肠道传输研究显示，微球通过与肠道黏液层的相互作用增强了结肠定植效果。组织学分析进一步证实，微球促进了结肠杯状细胞的增殖和黏液层的形成。宏基因组学和代谢组学分析结果表明，口服这种负载益生菌的微球显著丰富了肠道微生物多样性，并有助于维持肠道屏障的完整性，显示出调节肠道免疫功能的潜力。因此，(sCS-BC)/OKGM-SA系统整合了上消化道保护、结肠靶向输送、黏液黏附和益生菌增殖功能，为靶向益生菌输送提供了一种新策略。这项工作为设计下一代结肠靶向益生菌载体奠定了基础，并突显了其在调节肠道生态系统中的治疗潜力。

引言

益生菌是活的微生物，当以适当剂量服用时，可以为宿主带来健康益处。它们通过调节宿主黏膜和全身免疫或平衡肠道微生物群来发挥有益作用，从而增强营养吸收并维持肠道健康[1]。此外，益生菌还能抑制病原体的生长，维持肠道微生物群的平衡[2]，有助于预防和改善乳糖不耐受、肥胖、营养不良和炎症性肠病等状况。近年来，肠道微生物群与其他身体部位之间的复杂免疫机制得到了进一步阐明，特别是“肠-脑轴”[3]和“肠-肾轴”[5]等相互作用网络，这些机制已经得到了广泛验证。然而，无论其具体功能如何，口服益生菌的有效性从根本上取决于它们在胃酸环境中的存活能力、在肠道中的定植能力以及在目标部位的代谢活性。许多研究表明，为了使益生菌在结肠中发挥有效作用，其存活浓度必须至少达到10^7 CFU/mL[6]。然而，益生菌在工业加工、储存过程中以及恶劣的胃肠道环境（如胃酸和胆盐）中极易降解，这些因素大大降低了输送过程中的存活细胞数量，影响了它们到达结肠并实现定植的能力。

最近的研究表明，将益生菌封装在合适的输送系统中可以增强其在上消化道的存活率，并实现在下消化道的靶向释放[8]。两种常见的机制包括利用消化道的pH梯度来选择性地封装益生菌，以及利用肠道内的微生物活性催化封装材料的降解以实现益生菌的释放[9]。然而，消化道的pH值可能受到饮食摄入的影响[10]，仅依赖微生物降解的材料可能会面临释放不稳定的问题[11]。因此，将这两种机制协同整合可以克服它们的固有局限性，从而实现针对下消化道的靶向益生菌输送，并提高其效果。例如，海藻酸钙水凝胶珠系统（ACGs）已被用于罗伊氏乳杆菌的靶向输送，显著提高了其在模拟肠液中的细胞存活率[12]。同样，使用鱼油、大豆蛋白分离物和海藻酸钠（SA）通过乳化法封装的益生菌实现了超过96%的封装效率[13]。尽管这些研究为益生菌的胃肠道保护提供了有价值的见解，但益生菌的结肠黏附特性尚未得到广泛探索，这限制了其生理功能的充分发挥。

为了解决肠道黏附问题，大多数研究集中在使用与结肠黏液糖蛋白相互作用的生物黏附材料上，以使益生菌能够有效黏附在黏液层上并延长其在结肠中的停留时间[14]。例如，刘等人[15]开发了用Fe^3+交联的巯基化氧化魔芋葡甘露聚糖微凝胶，实现了在碱性肠道环境中的pH响应性释放，并随后黏附在黏液层上实现定植。同样，刘等人[16]设计了具有巯基化透明质酸核心和SA壳的黏膜黏附性抗炎微球，用于靶向肠道药物输送。然而，这些方法可能导致益生菌在上消化道过早黏附，从而限制了其效果。因此，迫切需要开发新的益生菌输送系统，以平衡存活率、释放和黏附性，确保高效地输送到结肠并实现长期定植。这样的系统将克服现有策略的局限性，最大化益生菌在肠道健康应用中的治疗潜力。

用于益生菌封装的材料必须具备pH响应性、稳定性、高生物相容性和可降解性。多糖水凝胶作为生物材料，符合这些要求[17][18][19]。魔芋葡甘露聚糖（KGM）是从魔芋中提取的天然多糖，可被结肠中的β-甘露聚糖酶降解。然而，其高分子量会导致黏度过高和增稠[20]，这不利于益生菌的封装。KGM的氧化降解（生成氧化KGM，OKGM）会产生自由羧基，从而在酸性胃环境中提高其稳定性。壳聚糖（CS）是一种阳离子多糖，能与肠道黏液层的阴离子成分发生静电相互作用[21]。然而，这种相互作用依赖于pH值，因为CS的溶解度和黏附性在碱性肠道环境中会降低。巯基化壳聚糖（sCS）通过与黏液糖蛋白和细菌细胞表面形成二硫键来克服这一限制，从而改善肠道黏附性。此外，细菌纤维素（BC）是一种由细菌产生的三维纳米纤维网络，由于其相互连接的纤维结构和丰富的氢键，具有很强的吸附能力[22]。因此，我们假设将CS掺入BC的多孔基质中不仅能够增强益生菌的黏附性，还能为结肠黏液提供额外的结合位点，从而优化其作为生物基载体的效果。

在这项研究中，我们开发了具有结肠靶向输送和黏膜黏附特性的(sCS-BC)/OKGM-SA微球（图1）。首先合成OKGM和sCS聚合物，然后将益生菌装载到BC纳米纤维上，接着用sCS进行交联形成sCS-BC悬浮液，从而增强了益生菌的封装和黏附性。接下来，使用sCS-BC作为W1相、OKGM作为W2相制备W1/O/W2双乳液，赋予其耐酸性和pH响应性。最后，将SA引入W1/O/W2双乳液中并进行离子交联，形成微球，提高了乳液的稳定性并防止益生菌的突然释放[23]。我们假设该系统能够提供pH响应性的胃酸保护，增强益生菌的存活率，实现β-甘露聚糖酶/碱性触发的结肠释放，促进通过二硫键介导的黏膜黏附，并驱动益生元微生物群的调节。设计的微球系统预计在整个上消化道中保持结构稳定性，在肠道条件下逐渐分解，释放乳液滴。随后sCS-BC的降解以及二硫键的形成预计会增强益生菌对肠道黏液的黏附。总之，(sCS-BC)/OKGM-SA输送系统有望实现有效的上消化道保护、结肠靶向释放、黏膜黏附性定植和促进益生菌增殖。基于这些潜在结果，进一步的宏基因组学和代谢组学分析有助于阐明其对肠道微生物群的影响，可能为肠道健康管理中的益生菌输送开辟新的途径。

材料

材料

乙酸杆菌（A. xylinus）、嗜酸乳杆菌 ATCC 4356（LA）和保加利亚乳杆菌 ATCC 11842（LB）来自陕西科技大学实验室（中国陕西）。KGM（葡甘露聚糖含量≥85%）购自湖北宜智魔芋科技有限公司（中国湖北）。CS（分子量700–800 kDa，脱乙酰化程度≥95%），SA（纯度≥90%，M/G比2:1），2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基（TEMPO），乙酰半胱氨酸（NAC），

OKGM的表征

为了提高KGM在酸性和碱性条件下的稳定性，我们通过TEMPO介导的氧化作用对其进行了氧化处理，显著降低了其聚合度和分子量（与天然KGM相比，见表1）。纤维素酶降解了KGM中的β-1,4-糖苷键，降低了溶液黏度并提高了流动性。在氧化过程中，部分糖苷键发生了广泛的降解，形成了寡糖[31]，这显著

结论

在这项研究中，我们使用OKGM、sCS和BC构建了一种结肠靶向的益生菌输送系统(sCS-BC)/OKGM-SA。嗜酸乳杆菌（LA）和保加利亚乳杆菌（LB）被装载到BC网络中，并通过W1/O/W2双乳液技术和离子交联进行封装。所得到的DE@LA和DE@LB微球表现出优异的稳定性和黏膜黏附性。

这些微球有效保护了益生菌免受模拟胃液和胆汁的伤害

CRediT作者贡献声明

任许宁：撰写——原始草稿、方法学、数据分析。张文：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。刘敏申：验证、方法学、实验研究。葛吉翔：软件开发、实验研究、数据管理。杨红：数据可视化、资源管理、项目管理。池桂林：数据可视化、资源管理、项目管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了陕西省教育厅资助的科学研究计划（项目编号：24JC016）和咸阳市“科学家+工程师”团队建设项目（项目编号：L2024-CXNL-KJRCTD-DWJS-0016）的支持。