《Frontiers in Immunology》：Aberrant STAT3 activation and overproduction of IL-21 in systemic lupus erythematosus: role of miR-155 and miR-21 in target genes SOCS1, PTEN and PIAS3
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本综述深入探讨了系统性红斑狼疮（SLE）中微小RNA（miR-155, miR-21）的异常表达如何通过靶向负向调控因子（SOCS1, PTEN, PIAS3），导致信号转导与转录激活因子3（STAT3）通路持续活化及白细胞介素21（IL-21）过表达的分子机制。研究揭示了SLE免疫失衡的新层面，为以miRNA或IL-21/STAT3轴为靶点的精准治疗策略提供了理论依据。
引言
系统性红斑狼疮（SLE）是一种慢性、炎症性、多系统自身免疫性疾病。其免疫系统激活的特征是B淋巴细胞和T淋巴细胞的过度反应以及对自身抗原的免疫耐受丧失，影响多个器官和系统。有缺陷的抗体产生和清除、循环和组织中免疫复合物的沉积、补体激活以及促炎细胞因子共同促进了SLE的发病机制。因此，T淋巴细胞和B淋巴细胞的扩增和存活，以及维持生发中心（GC）以产生长寿的自身抗体分泌浆细胞，在SLE的病理生理学中至关重要。
白细胞介素21（IL-21）是一种主要由滤泡辅助性T细胞（Tfh）、循环滤泡辅助性T细胞（cTfh）、外周辅助性T细胞（Tph）、辅助性T细胞17（Th17）和TNK细胞产生的促炎细胞因子，它们直接参与SLE的发病机制。IL-21是一种多效性细胞因子，影响先天性和适应性免疫细胞。它促进T细胞的增殖、GC形成和维持以及分化，以及自身抗体分泌浆细胞的分化。其效应通过IL-21受体（IL-21R）经由信号转导与转录激活因子3（STAT3）信号通路介导。
微小RNA（miRNAs）是基因表达的转录后调节因子，通过碱基配对启动其靶基因信使RNA（mRNAs）的降解或抑制其翻译。它们参与许多生物过程，如细胞分化、发育、信号传导和免疫，例如与包括SLE在内的各种自身免疫性疾病中炎症反应相关的microRNA-155（miR-155）和microRNA-21（miR-21）。这些miRNA影响细胞因子信号传导抑制因子1（SOCS1）、磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）以及活化STAT3的蛋白抑制剂（PIAS3）等基因的表达，这些基因是STAT3信号通路的负向调节因子，其改变可能有助于SLE患者中观察到的免疫失衡。在SLE患者中已观察到miR-155和miR-21的过表达，并且已被证明靶向STAT3通路调节基因SOCS1、PTEN和PIAS3，这是主要的IL-21信号通路。
本研究评估了SLE患者外周血单个核细胞（PBMC）中IL21的表达，以及miR-155和miR-21与SOCS1、PTEN和PIAS3表达之间的关联。分析了这种相互作用如何影响这些患者的STAT3信号通路。该分析可能为理解SLE的分子调控机制提供进一步见解，并有可能确定治疗SLE的新靶点。
材料与方法
患者与健康对照
本研究共纳入58名受试者，包括30名SLE患者和28名健康对照（HC）。所有患者均来自墨西哥哈利斯科州西方综合医院的风湿科服务，并符合2019年EULAR/ACR的SLE分类标准。在纳入时确定了SLE患者的墨西哥版系统性红斑狼疮疾病活动指数（Mex-SLEDAI）评分、系统性红斑狼疮疾病活动指数（SLEDAI-2K）和系统性狼疮国际合作诊所（SLICC）损伤指数评分。临床和免疫学数据取自医疗记录。本研究遵循《赫尔辛基宣言》和参与机构研究委员会制定的伦理标准和原则。并获得西方综合医院伦理与研究委员会（批准号CEI-146/21和CI-146/21）以及瓜达拉哈拉大学（批准号CI-02123）的批准。在纳入前，所有参与者均根据墨西哥《健康研究通用卫生法》的规定签署了知情同意书。
PBMC分离与刺激
从肝素抗凝管采集的静脉血样本中分离外周血单个核细胞（PBMC）。使用Histopaque-1077通过密度梯度离心法分离PBMC。洗涤后的细胞重悬于补充有10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养液中。将PBMC以1x106个细胞/mL的浓度接种于24孔平底细胞培养板中。PBMC在37°C、5% CO2条件下培养16小时。孵育后，移除培养液，更换为新鲜培养基，然后使用0.5 μg/mL离子霉素（IONO）和2.5 μg/mL佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）进行刺激。细胞分为四个实验组：用0.5μg/mL离子霉素和2.5μg/mL PMA刺激的SLE患者PBMC、未刺激的SLE患者PBMC（在相同条件下培养但不加刺激物）、刺激的HC PBMC和未刺激的HC PBMC。随后，将1x106个细胞/mL在37°C、5% CO2条件下分别孵育3小时用于mRNA表达定量分析，孵育24小时用于蛋白质印迹法（Western blot）蛋白质定量。在24小时孵育后收集无细胞上清液以评估IL-17A浓度，并储存于-40°C直至检测。
RNA提取与定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）
为分析mRNA和miRNA表达水平，使用TRIzol试剂从PBMC沉淀中提取总RNA。每个条件从1x106个细胞中提取RNA。使用NanoDrop lite光谱仪通过260 nm相对吸光度和260/280 nm比值测量确认RNA浓度和纯度。miRNA的逆转录使用TaqMan Advanced miRNA Assay cDNA合成试剂盒进行。我们通过RT-qPCR使用TaqMan探针定量miR-155和miR-21的水平。使用2 μg总RNA/样本。polyA加尾反应条件为37°C 45分钟和65°C 10分钟，随后是接头连接反应16°C 60分钟，以及逆转录42°C 15分钟，最后85°C孵育5分钟。扩增反应（miR-Amp）在95°C 3秒进行14个循环的变性，60°C 30秒进行1个循环的退火，以及99°C 10分钟进行1个循环的最终反应。使用TaqMan Fast Advanced Master Mix进行RT-qPCR，酶激活条件为95°C 20秒，随后进行40个循环的95°C 1秒变性和60°C 20秒退火/延伸。为定量SOCS1、PTEN、PIAS3和IL21基因，使用2 μg总RNA通过M-MLV-Oligo (dT) cDNA合成试剂盒进行逆转录，反应条件为65°C 5分钟，42°C 60分钟和85°C 5分钟。样本保存于-80°C直至使用。qPCR使用TaqMan探针，孵育条件为：50°C 2分钟，95°C 20秒，以及40个循环的95°C 1秒和60°C 20秒。RT-qPCR在实时荧光定量PCR仪上进行。miR-320a用作miR-155和miR-21表达的内参，GAPDH用作SOCS1、PTEN、PIAS3和IL21表达的内参。每个样本重复分析两次。Ct值超过40的被排除在分析之外（认为可靠性较低）。
蛋白质提取与蛋白质印迹法（Western Blot）
我们在刺激后24小时收集所有细胞。使用补充了蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的1X RIPA裂解缓冲液从4x106个细胞中提取总蛋白质。通过考马斯亮蓝染色与Bradford试剂进行蛋白质定量。将20 μg总蛋白质在还原条件下于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上分离，然后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，该膜在4°C下用含0.1% Tween 20的5%脱脂奶粉封闭2小时。随后，膜与特异性一抗，抗IL-21、酪氨酸705位点（Y705）磷酸化的STAT3（p-STAT3）、SOCS1、PTEN和PIAS3在4°C下孵育过夜。然后，膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，抗小鼠m-IgG和抗兔IgG在室温摇荡下孵育1.5小时。随后使用Immobilon HRP底物进行化学发光显影，并使用数字化学发光系统捕获图像。使用GelQuant.NET软件分析每个蛋白质条带的灰度强度值，并将每个值归一化至相应的内参蛋白质条带。β-肌动蛋白（β-actin）用作上样对照。
酶联免疫吸附测定（ELISA）
在样本采集时从每位受试者的全血中分离血浆，并储存于-20°C直至使用。使用ELISA MAX? Deluxe Set Human IL-21测定IL-21水平浓度，同时使用Human IL-17 Quantikine ELISA Kit定量IL-17A浓度，均按照制造商说明进行操作。所有测定均重复进行。使用酶标仪在450 nm和570 nm测量吸光度。根据标准曲线计算细胞因子浓度，并以pg/mL表示。
统计分析
使用IBM SPSS statistics v25和GraphPad Prism v10.2.3软件包进行统计分析。Shapiro–Wilk检验用于确定正态分布。分类变量以绝对值和百分比表示，而连续变量以中位数和第25-75百分位数表示。Mann–Whitney U检验用于比较两组间的差异，Kruskal–Wallis检验与Dunn's检验作为事后检验用于多重比较。Spearman检验用于计算相关性。p ≤ 0.05的值被认为具有统计学显著性。ANCOVA用于多元线性回归。对于每个RT-qPCR运行，使用仪器的默认阈值设置来计算CT。使用比较CT法（2-ΔΔCt）计算mRNA表达的倍数变化，使用2-ΔCt计算相对mRNA和miRNA表达。
结果
人口统计学和临床特征
本研究共纳入58名参与者，包括30名SLE患者和28名HC。全部为女性，SLE患者中位年龄为40岁，HC为26岁。疾病病程为10年。疾病活动度评分中位数，SLEDAI-2K为1分，Mex-SLEDAI为1.5分，90%的SLE患者处于非活动/轻度活动状态（SLEDAI-2K评分0-5）。此外，大多数患者根据SLICC损伤指数评分为0分，无损伤。临床表现和当前治疗的频率见表1。
miR-155和miR-21表达增加与IL-21信号通路中SOCS1、PTEN和PIAS3水平降低相关
为了分析miR-155和miR-21对IL-21信号通路调节分子的影响，我们评估了刺激和未刺激的SLE患者和HC的PBMC中miR-21、miR-155以及SOCS1、PTEN、PIAS3和IL21的表达。SLE患者PBMC中的miR-155和miR-21水平显著高于HC。在PMA+IONO刺激后，两组中的miR-155和miR-21表达均增加，且在SLE患者中更高。与此一致的是，SOCS1和PTEN在SLE患者刺激和未刺激的PBMC中表达下调。PIAS3表达的差异在刺激后未维持。当我们评估未刺激的PBMC时，在SLE患者和HC中未观察到IL21表达。相反，在用PMA+IONO刺激后，与HC相比，SLE患者中IL21表达显著增加。
miR-155和miR-21水平升高与其靶基因SOCS1、PTEN和PIAS3表达降低相关
使用计算预测工具，我们确定SOCS1和PTEN是miR-155的靶标，而SOCS1、PTEN和PIAS3是miR-21的靶标。为了确定SOCS1/PTEN-miR-155和SOCS1/PTEN/PIAS3-miR-21相互作用在SLE中的生物学意义，我们比较了SLE患者和HC PBMC中miRNA与其靶基因的表达。我们假设SLE中miR-155和miR-21的过表达可能是SOCS1、PTEN和PIAS3表达降低的结果。
SLE患者PBMC中SOCS1、PTEN和PIAS3表达降低并通过p-STAT3可能提供IL-21的正反馈
为了评估我们SLE患者中IL-21/STAT3信号通路的激活，我们测量了刺激和未刺激PMA+IONO的PBMC中IL-21、p-STAT3、SOCS1、PTEN和PIAS3的蛋白质表达。蛋白质印迹结果显示，与未刺激的HC相比，未刺激的SLE患者PBMC具有更高的IL-21蛋白质表达、更高的p-STAT3蛋白质表达，以及更低的SOCS1、PTEN和PIAS3蛋白质表达。此外，在PMA+IONO刺激PBMC后，IL-21和p-STAT3仍然较高，而SOCS1和PIAS3蛋白质表达与刺激的HC相比更低。PTEN蛋白质表达无显著差异。
与HC相比，SLE患者中促炎细胞因子IL-21和IL-17A增加
SLE患者的血浆IL-21水平显著高于HC。有趣的是，在疾病非活动性和活动性患者之间未观察到显著差异。此外，SLE患者的培养上清液中IL-21和IL-17水平也高于HC。
SLE中miR-155和miR-21与其调节靶点呈负相关
在未刺激的HC PBMC中，我们发现miR-155表达与其靶基因SOCS1和PTEN呈负相关。在用PMA+IONO刺激后，miR-155仍然与SOCS1和PTEN呈负相关。此外，miR-155与IL21表达呈正相关。我们还观察到miR-21与其靶基因SOCS1呈负相关，与IL21呈正相关。在未刺激的SLE患者中，观察到miR-155与其靶基因SOCS1之间呈负相关，以及miR-21与其靶基因PTEN和PIAS3之间呈负相关。刺激后，在SLE患者中，miR-155表达与其靶基因SOCS1呈负相关。
通过ANCOVA评估年龄和药物治疗作为协变量
为了确定观察到的SLE患者和HC之间的差异是否独立于年龄或药物治疗，我们进行了协方差分析（ANCOVA），以组别为因子，年龄、泼尼松、抗疟药和硫唑嘌呤为协变量。在所有评估的标志物中，包括miRNA（miR-155, miR-21）、其调节分子（SOCS1, PTEN, PIAS3）和p-STAT3在PMA+IONO刺激前后以及IL-21，在调整后，组别效应、年龄效应或抗疟药效应均未显示与这些变量水平的显著关联，表明在我们的队列中，年龄不是混杂因素，并且组间描述性差异不能由年龄或抗疟药治疗解释。泼尼松与IL-21蛋白质表达（未刺激和PMA+IONO刺激）以及PMA+IONO刺激下的PIAS3 mRNA显示显著关联。硫唑嘌呤仅与未刺激的miR-21表达和未刺激的PTEN蛋白质表达显著相关。然而，所有VIF值保持较低，表明共线性最小，并证实这些治疗效应不影响模型解释。在调整药物治疗后，组间差异仍然存在，支持在这些分子中观察到的改变是由病理驱动而非治疗效应。
讨论
SLE是一种以抗体产生、免疫复合物沉积和促炎细胞因子为特征，随后导致组织损伤的自身免疫性疾病。SLE中的免疫系统激活包括异常的B淋巴细胞和T淋巴细胞反应以及对自身抗原的免疫耐受丧失，这影响多个器官和系统。IL-21是由T细胞亚群、Tfh、cTfh、Tph和Th17细胞产生的重要细胞因子。IL-21通过激活B细胞并促进这些细胞分化为自身抗体分泌浆细胞（SLE的特征）在这一过程中发挥关键作用。IL-21通过STAT3通路发出信号，该通路在不同水平上受到抑制因子如SOCS1、PTEN和PIAS3的调节，这些抑制因子形成负反馈环以减弱信号传导。此外，miRNA在转录后基因调控中起关键作用，特别是miR-155和miR-21已通过靶向IL-21信号通路的调节分子SOCS1、PTEN和PIAS3而被牵涉于如SLE的自身免疫性疾病中。
我们的研究旨在比较SLE患者PBMC中IL21表达与STAT3信号通路调节基因的表达。我们的结果显示，SLE患者PBMC中miR-155和miR-21表达显著增加。类似地，先前的报告在SLE患者的PBMC、外周血、CD4+ T细胞、外泌体、血清和血浆中观察到miR-155和miR-21表达增加。然而，这些研究大多未探索它们对靶基因的功能影响及其与疾病的关系。
miR-155和miR-21的过表达与免疫系统细胞活化、增殖和促炎细胞因子的产生有关。miR-155已被广泛研究，并因其在T细胞增殖、分化和发育中的作用而被认为是SLE中的关键miRNA。最近的研究表明，其过表达有助于B细胞和T细胞过度活跃，促进自身抗体产生增加，并加剧SLE特有的炎症。此外，miR-155通过负向调节配对盒基因5（PAX5）在浆细胞的命运决定中至关重要。还有报道称，miR-155通过调节B母细胞、浆母细胞的存活和增殖以及抗体产生来控制滤泡外反应的程度。Chauhan等人报道，miR-155在抗双链DNA（抗-dsDNA）阳性的SLE患者中呈正调节。最后，miR-155表达增加与外周双阴性（DN）B细胞频率增加相关，这也被报道在SLE患者中扩增。另一方面，miR-21除T细胞外，还被发现在B细胞中过表达。miR-21已被证明能促进自身反应性B细胞的存活和增殖，并抑制T细胞的调节功能。值得注意的是，在SLE患者中，miR-21与抗-dsDNA存在关联。Salvi等人，2018年证明，miR-21在体外激活人血中浆细胞样树突状细胞（pDC）分泌I型干扰素（IFN），并且这种效应在SLE患者中增强。它还诱导促炎细胞因子TNF-α和IL-6的分泌。另一项研究观察到，miR-21参与SLE中B细胞耐受性的丧失和自身反应性B细胞的发育、GC反应以及抗体形成细胞（AFCs）的发育。
除了miR-155和miR-21的调节作用外，考虑它们与关键基因如SOCS1、PTEN和PIAS3的相互作用也很重要，这些基因作为免疫反应的关键调节剂。我们的结果显示，SLE患者的SOCS1、PTEN和PIAS3的mRNA和蛋白质表达低于HC。与我们的结果类似，其他研究报道SLE患者中SOCS1表达降低。SOCS1表达在其他疾病中也减少，证明T细胞中SOCS1缺陷会激活增殖和IFN-γ分泌，通过抑制JAK2/STAT3通路导致疾病加剧。SOCS1是STAT3信号通路的负向调节因子，作为炎症抑制因子发挥重要作用。先前的研究表明，活动性SLE患者的SOCS1表达低于非活动性疾病患者。SOCS1缺陷增强炎症并促进促炎细胞因子的分泌，加剧这些患者的免疫失衡。Takahashi等人，2011年发现，Foxp3+调节性T（Treg）细胞在SOCS1缺陷时倾向于显示增加的可塑性并偏向于1型辅助T细胞（Th1）/Th17表型。他们观察到，与IFN-γ?/?SOCS1+/+Treg细胞相比，IFN-γ-/-SOCS1-/-Treg细胞具有STAT3的过度活化和IL-17A产生增加。因此，他们提出SOCS1通过维持Foxp3表达和抑制STAT3驱动的IL-17A产生来维持Treg细胞的完整性和功能。
PTEN表达的降低或缺失也可能导致炎症性疾病，如SLE，因为它是相同STAT3信号通路的重要调节因子，促进自身反应性细胞的存活并加剧该疾病的病理。与我们的结果类似，Cui等人，2017年报道，SLE患者的PTEN表达显著低于HC，并且与活动性SLE患者低于非活动性SLE患者相关。此外，一项研究发现，与非狼疮性肾炎组相比，狼疮性肾炎组的PTEN mRNA表达降低。Wu等人，2014年观察到，除记忆B细胞外，所有SLE B细胞亚群均显示与HC B细胞相比PTEN表达减少。此外，PTEN表达水平与疾病活动度呈负相关。其他研究发现，PTEN过表达通过调节Th17和Treg之间的平衡来减少T细胞活化、STAT3活性和Th17细胞分化，并可能通过抑制Th1和Tfh细胞反应来增强Treg细胞稳定性。Treg细胞中PTEN耗竭导致过度的Tfh和生发中心细胞反应以及自发性炎症性疾病。PTEN还被证明通过抑制IL-2产生来调节Th17细胞分化。PTEN缺陷增加IL-2表达和STAT5磷酸化，但减少STAT3磷酸化，从而抑制Th17细胞分化。PIAS3通过抑制STAT3通路信号发挥作用；据我们所知，这是首次在SLE患者中报道PIAS3。刺激后，PIAS3 mRNA表达在SLE患者和HC之间未显示显著差异。然而，观察到该调节因子的下降趋势。与我们的结果类似，在其他疾病中有研究，如多形性胶质母细胞瘤、肺癌、乳腺癌、类风湿性关节炎（RA）、子宫内膜异位症和银屑病病变，其中观察到低PIAS3表达，同时STAT3激活增加。Tang等人，2016年观察到PIAS3 mRNA表达与STAT3 mRNA表达以及Th17细胞百分比呈负相关。因此，SOCS1、PTEN和PIAS3表达减少可能导致STAT3信号通路的组成型激活，有助于SLE患者中不受控制的炎症反应。
另一方面，在任何研究组的基线条件下均未检测到IL21 mRNA表达。然而，在这些条件下观察到了IL-21蛋白质的存在。在用PMA+IONO刺激后，SLE患者中IL21 mRNA和IL-21蛋白质表达均显著增加。这些结果反映了IL-21调控中一个有趣的现象。在基线条件下，观察到SLE患者在未刺激的PBMC中没有IL21 mRNA表达，这可能归因于细胞因子mRNAs的短半衰期，特别是在缺乏特定刺激来稳定其转录的情况下。然而，在相同条件下IL-21蛋白质的存在可能反映了蛋白质与其mRNA相比更稳定的性质。这可能是因为一旦合成，蛋白质在更长时间内保持功能，或者受到根据其功能和调控调节其降解的机制的保护，从而允许其检测，即使mRNA生产未在进行中。我们的结果显示，在用PMA+IONO刺激后，与HC相比，SLE患者PBMC中IL21表达有相当大的2538倍增加。这表明在如SLE的炎症环境下，更多的mRNA被转录。IL-21正向调节其在外周血CD3+淋巴细胞中的表达。这种自体调节机制，在如IL-21的自分泌细胞因子中很常见，在SLE中尤其相关，其中过量的IL-21产生产生正反馈环。这不仅放大了细胞活化，还增强了关键通路（如STAT3）的信号传导，有助于疾病的发病机制。此外，细胞因子刺激诱导Y705 STAT3磷酸化，而S727更受细胞基础激活状态的影响。另外，IL21
