《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Protective effect of a novel hydrogel loaded with CM-UCMSCs on vitrified–thawed ovaries during in vitro culture
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本文报道了一种新型抗氧化水凝胶（PG-gel）负载脐带间充质干细胞条件培养基（CM-UCMSCs）在玻璃化冻存卵巢组织体外培养中的保护作用。研究表明，该复合系统通过其巯基活性及生物活性因子的缓释，显著抑制活性氧（ROS）生成、减少卵泡丢失、改善卵泡形态、降低胶原沉积与细胞凋亡（TUNEL阳性细胞及caspase-3表达下降），并增强葡萄糖消耗。转录组分析显示其可下调凋亡相关基因（Ddit3、Trib3、Hmox1），上调线粒体代谢基因（Mt-atp8、Mt-nd1、Mt-cyb），从而通过调控凋亡信号和增强线粒体能量代谢，为卵巢组织冷冻移植（OTCT）提供了一种有前景的辅助策略。
引言
卵巢组织冷冻移植（OTCT）是女性癌症患者生育力保存的重要方法，但其疗效受移植后缺血再灌注损伤的限制，导致氧化应激、细胞凋亡和纤维化，损害卵巢储备功能和移植物功能。间充质干细胞条件培养基通过旁分泌作用显示出治疗潜力，但其临床应用受到相对有限的抗氧化能力和递送挑战的限制。为解决这一问题，本研究开发了一种富含抗氧化剂的水凝胶（PG-gel），由N-乙酰半胱氨酸（NAC）修饰的明胶和聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯（PEG-SS）制成，并负载脐带间充质干细胞条件培养基（CM-UCMSCs），旨在评估PG-gel在玻璃化冻存卵巢组织体外培养中的保护功效。
材料与方法
2.1 PG-gel与CM-UCMSCs/DMEM负载PG-gel的制备
PEG-SS的合成参照团队先前方法，通过聚乙二醇（PEG，分子量6000 Da）与琥珀酸酐反应生成羧基封端PEG，再与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）反应制得。NAC-明胶采用两步法合成：首先将猪皮明胶与无水乙二胺在PBS中反应生成氨基明胶（Agelatin），再与NAC在EDC催化下反应生成NAC-明胶。通过1H NMR光谱确认结构。将20 wt% NAC-明胶溶液（溶于0.1M NaH2PO4）与10 wt% PEG-SS溶液（溶于0.1M Na2HPO4）等体积混合形成PG-gel；以DMEM或CM-UCMSCs替代Na2HPO4溶液可制得DMEM负载PG-gel或CM-UCMSCs负载PG-gel。
2.2 形态与元素分析
通过扫描电子显微镜-能谱仪（SEM-EDS）对材料进行表征。结果显示，负载CM-UCMSCs后PG-gel呈现多孔结构，碳、氧和硫元素重量百分比分别为1.02 wt%（纯PG-gel）和0.99 wt%（CM-UCMSCs负载PG-gel），原子百分比均为0.42%。
2.3 ABTS自由基清除实验
ABTS自由基清除实验表明，CM-UCMSCs负载PG-gel具有最强的自由基清除能力，依次高于DMEM负载PG-gel、PG-gel、CM-UCMSCs和DMEM培养基，各组间差异均具统计学意义（P < 0.05）。
2.4 抗氧化能力测定
采用过氧化物敏感荧光探针2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测人卵巢颗粒细胞系（KGN）内活性氧（ROS）水平。过氧化氢（H2O2，10 μM）处理24小时后，ROS水平从高到低依次为H2O2组、CM-UCMSCs组、PG + DMEM组、PG + CM-UCMSCs组和空白组，组间差异显著。PG-gel的巯基可中和KGN细胞产生的ROS生成无害产物如H2O和O2，而负载的CM-UCMSCs释放的生物活性因子（如外泌体）也参与清除ROS。
2.5 粘附强度测试
采用猪皮进行粘附强度测试，结果显示PG-gel、DMEM负载PG-gel和CM-UCMSCs负载PG-gel的粘附强度分别为12.49 ± 0.86 kPa、20.31 ± 2.04 kPa和21.66 ± 1.41 kPa。后两者粘附强度显著高于PG-gel（P < 0.001），且CM-UCMSCs负载PG-gel在水流和扭转条件下在猪皮上保持稳定，显示优异粘附性。
2.6 卵巢收集、冷冻保存与解冻
实验动物为8周龄雌性SD大鼠（180–200 g），卵巢组织修剪为2 × 1 × 1 mm大小，使用存活组织冷冻复苏试剂盒进行玻璃化冷冻：依次在V1溶液（室温，10分钟）、V2溶液（20分钟）中处理后液氮保存。1个月后，组织在37°C T1溶液中解冻3分钟，再依次转入T2和T3溶液（室温，各10分钟）以备实验。
2.7 CM-UCMSCs的制备
从足月健康新生儿采集脐带，去除血液后剪碎，贴壁培养脐带间充质干细胞（UCMSCs）。取第3–4代细胞，换用无血清DMEM/F12培养基培养48小时，收集上清液，离心后获得CM-UCMSCs，分装保存于-80°C。
2.8 分组与体外培养系统
实验设6组：DMEM组、CM-UCMSCs组、PG + DMEM组、PG + CM-UCMSCs组（以上4组进行体外培养），以及对照组（新鲜卵巢组织）和玻璃化冻存组（仅经冷冻复苏处理）。培养组将卵巢组织置于培养皿底部，添加相应培养基，37°C、5% CO2培养2天；PG-gel置于上室缓慢扩散至培养系统。
2.9 苏木精-伊红（HE）染色与Masson三色染色
卵巢组织石蜡切片进行HE染色，光镜下计数卵泡。卵泡分为健康卵泡（原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡）和不健康卵泡（闭锁卵泡和囊状卵泡）。Masson染色显示胶原纤维呈蓝色，计算胶原沉积面积比（胶原纤维化面积/总组织面积）。结果显示，PG + CM-UCMSCs组卵泡丢失较少，不健康卵泡百分比低于DMEM组（P < 0.05），胶原沉积面积比也显著降低。
2.10 免疫荧光与免疫组织化学
TUNEL检测细胞凋亡，绿色荧光标记凋亡信号，DAPI染核。免疫组化检测caspase-3和8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）。定量分析显示，PG + CM-UCMSCs组凋亡率、caspase-3阳性率和8-OHdG平均光密度（MOD）均为体外培养组中最低，与DMEM组差异显著。
2.11 葡萄糖测定
测定培养前后培养基葡萄糖浓度差值，PG + CM-UCMSCs组差值最大，显著高于DMEM组（P = 0.006），表明其促进葡萄糖消耗，改善能量代谢。
2.12 RNA测序
对DMEM组、PG + CM-UCMSCs组和对照组进行RNA测序。与DMEM组相比，PG + CM-UCMSCs组有96个差异表达基因（75个上调、21个下调）。聚类分析将基因分为10类，其中Cluster 1（9个基因）与凋亡相关（如Slc1a4、Sqstm1、Ddit3、Trib3、Hmox1），表达在DMEM组最高，PG + CM-UCMSCs组次之，对照组最低；Cluster 2（40个基因）与线粒体和能量代谢相关（如Mt-atp8、Mt-nd1、Mt-cyb），表达趋势相反。KEGG富集分析显示DMEM组上调基因富集于铁死亡、mTOR信号通路等，下调基因富集于氧化磷酸化、氮代谢、牛磺酸代谢、PPAR信号通路等。
2.13 统计分析
数据以均值±标准差表示，采用SPSS 26.0进行统计分析，P < 0.05为显著差异。
结果
3.1 PG-gel的抗氧化能力与粘附特性
NAC修饰明胶成功引入巯基，1H-NMR谱图显示8.5–8.7 ppm处出现NAC的NH基团特征峰。SEM-EDS证实负载CM-UCMSCs后PG-gel呈多孔结构。ABTS和DCFH-DA实验均表明CM-UCMSCs负载PG-gel具有最强抗氧化能力。粘附测试显示其具有良好的组织粘附性。
3.2 CM-UCMSCs负载PG-gel保护卵泡并抑制卵巢纤维化
HE染色显示PG + CM-UCMSCs组卵泡丢失最少，不健康卵泡百分比显著低于DMEM组。Masson染色显示其胶原沉积面积比最低，抑制纤维化效果显著。
3.3 CM-UCMSCs负载PG-gel抑制体外培养卵巢的凋亡
TUNEL和免疫组化（caspase-3、8-OHdG）结果显示PG + CM-UCMSCs组凋亡指标最低，表明其能有效抑制细胞凋亡和氧化DNA损伤。
3.4 CM-UCMSCs负载PG-gel促进卵巢葡萄糖消耗
葡萄糖消耗量在PG + CM-UCMSCs组最高，提示其增强能量代谢。
3.5 CM-UCMSCs负载PG-gel调控凋亡和能量代谢相关基因表达
RNA测序表明PG + CM-UCMSCs组凋亡相关基因表达下调，线粒体代谢基因表达上调，KEGG分析提示其通过调控铁死亡、mTOR、氧化磷酸化等通路发挥保护作用。
讨论
OTCT面临移植后缺血缺氧导致的卵泡丢失、纤维化、氧化应激和凋亡等挑战。本研究创新性地将PG-gel与CM-UCMSCs结合，应用于玻璃化冻存卵巢体外培养系统。PG-gel通过巯基提供抗氧化保护，CM-UCMSCs则提供多种生物活性因子（如VEGF、IGF-1），二者协同作用。该系统显著改善卵泡形态、抑制纤维化和凋亡，并促进能量代谢，其机制涉及凋亡信号通路抑制和线粒体功能增强。尽管本研究在静态培养系统中验证了初步疗效，未来需开展体内移植实验，并整合代谢组学等进一步阐明机制。
结论
CM-UCMSCs负载PG-gel系统在玻璃化冻存卵巢体外培养中表现出全面的保护作用，包括减少卵泡异常、抑制纤维化、降低凋亡和氧化应激，其机制与凋亡基因下调、线粒体代谢增强相关。该策略为优化OTCT临床结局提供了新的技术平台和理论依据。
