《Frontiers in Immunology》：VNAR: shark single-domain antibodies for the new era of medical biotechnology
编辑推荐：
本综述系统阐述了鲨鱼源性单域抗体VNAR的独特优势，其小型化结构、卓越稳定性及穿透性使其在靶向传统抗体难以触及的表位方面表现突出，尤其在肿瘤微环境穿透、血脑屏障跨越等场景潜力巨大。文章详述了其结构分类、展示技术及人源化策略，为开发新一代诊断工具与疗法提供了关键见解。
在医学生物技术领域，鲨鱼衍生的单域抗体VNAR正以其独特的结构和功能特性掀起一场革命。这些仅由重链可变区组成的微小蛋白，分子量约12-15 kDa，却拥有传统抗体难以企及的稳定性、溶解性和组织穿透能力。
1 引言
抗体是机体抵御病原体的关键蛋白。传统抗体虽功能强大，但其大分子量约150 kDa和复杂结构限制了其在某些场景的应用。这促使科学家寻找更小巧、更稳定的替代品，从而发现了单域抗体。20世纪90年代，研究人员在软骨鱼和骆驼科动物中发现了缺乏轻链的新型抗体。其中，鲨鱼体内的免疫球蛋白新抗原受体可变区即VNAR，以其微小的体积和独特的结构引起了广泛关注。
2 VNAR的起源、结构特征及生物医学应用
2.1 软骨鱼适应性免疫系统的进化发展
软骨鱼是现存最古老的有功能性适应性免疫系统的脊椎动物。其免疫系统包含IgM、IgW和独特的IgNAR。VNAR正是IgNAR的可变区。鲨鱼的免疫系统缺乏骨髓和淋巴结，但拥有肠道相关淋巴组织、胸腺以及特有的淋巴髓样组织如epigonal器官和Leydig器官。VNAR的生成始于B细胞通过V(D)J体细胞重组产生多样性，其CDR3区尤其长且多样，甚至可超过25个氨基酸残基，这使其能够识别隐蔽表位。
2.2 VNAR的结构特征与折叠
VNAR保持着典型的Ig样折叠，但其结构与传统抗体的VH区有显著差异：它们缺乏经典的CDR2，但拥有两个主要的功能性高变环CDR1和CDR3。CDR3环的长度和序列多样性极高，提供了巨大的抗原接触表面。
2.3 结构分类：I、II、III和IV型
根据CDR和框架区内非经典半胱氨酸残基的数量和位置，VNAR被分为四种经典类型。I型和II型VNAR通过额外的二硫键稳定其CDR3环，形成特殊的构象，便于接触难以接近的靶标。IV型则结构最简单，仅保留经典二硫键。
2.4 稳定性与理化性质
VNAR最显著的特性之一是其非凡的结构稳定性。它们能在65-80°C以上保持结构和功能，抵抗极端pH、去污剂和有机溶剂，并具有高抗蛋白酶水解能力。然而，其小分子量也导致血清半衰期短，需要通过融合人血清白蛋白、Fc片段或PEG化等策略来延长半衰期。
3 用于VNAR选择的展示技术
3.1 噬菌体展示
这是目前应用最广泛的VNAR筛选技术。将VNAR编码序列与噬菌体外壳蛋白融合，使每个噬菌体表面展示一个独特的VNAR，通过多轮生物淘选富集高亲和力结合物。其优势在于库容量大，但可能存在宿主选择偏好。
3.2 核糖体展示
这是一种完全离体的筛选技术，核糖体、新生肽和mRNA形成稳定复合物，可直接与靶抗原孵育。该方法无需细胞转化，库容量可达1012–1014，筛选速度快，且易于进行体外亲和力成熟。
3.3 酵母展示
该技术将VNAR展示在酵母细胞表面，可通过流式细胞术进行定量筛选，直接评估亲和力、特异性和表达水平。其真核表达系统有利于正确形成二硫键，特别适合结构复杂的VNAR。
3.4 细菌表面展示
将VNAR展示在细菌表面，成本低、易扩展，适用于高通量筛选和定量亲和力成熟，在相关单域抗体格式中已得到验证。
4 生成VNAR来源与库
VNAR可通过多种方式获得：来自免疫鲨鱼的免疫库，其结合物经过体内亲和力成熟，通常具有高亲和力；来自非免疫鲨鱼的天然库，库多样性广，可针对多种抗原进行筛选；半合成库结合了天然支架和体外引入的多样性，设计灵活；全合成库则完全基于设计的共识支架，可探索更广泛的序列空间。
5 生物医学所需的结构特性
VNAR的小尺寸使其具有出色的组织穿透力，尤其能进入致密的肿瘤微环境。其“指状”互补位结构，特别是突出的CDR3环，能结合传统抗体无法触及的隐藏表位。卓越的热稳定性和高溶解度简化了制剂和储存。此外，VNAR可在原核系统如大肠杆菌中高效表达，易于进行遗传改造，可构建成双特异性、CAR-T等多种治疗形式。
6 VNAR在生物医学中的应用
6.1 在免疫诊断中的应用
VNAR的稳定性使其在高温下仍能保持活性，非常适合在资源有限地区开发无需冷链的快速诊断试纸条。它们已被用于检测疟疾、霍乱毒素、埃博拉病毒、乙肝病毒等病原体的生物标志物，显示出高灵敏度和特异性。
6.2 免疫疗法与癌症
VNAR的小尺寸和独特结合能力使其在肿瘤治疗中优势明显。它们可抑制肿瘤细胞增殖、干扰生长因子受体信号传导，并可用于构建CAR-T细胞。例如，靶向PD-L1的VNAR B2已被用于构建CAR-T细胞，在临床前模型中有效抑制了三阴性乳腺癌和肝癌的生长。其穿透致密肿瘤微环境的能力为实体瘤治疗带来了希望。
6.3 感染性疾病
VNAR能够靶向病毒高度保守或难以接近的序列，对抗快速变异的病原体。已成功筛选出针对SARS-CoV-2刺突蛋白RBD域、乙肝表面抗原、流感A病毒M2离子通道等的VNAR，其中一些显示出广谱中和活性。
6.4 自身免疫与炎症性疾病
- •
类风湿关节炎：已开发出靶向TNF-α、ICOSL等关键炎症介质的VNAR，在动物模型中显示出优于传统药物的疗效。
- •
血脑屏障：BBB是药物入脑的主要障碍。VNAR TXB2能高效结合转铁蛋白受体1TfR1，作为“分子穿梭车”将治疗性载荷运送到大脑，为神经系统疾病治疗开辟了新途径。
- •
角膜穿透：VNAR的小分子量使其能够通过滴眼液形式穿透角膜，无需眼内注射。针对眼部血管疾病因子VEGF165和葡萄膜炎相关靶点的VNAR已在动物模型中展现出治疗潜力，为眼部疾病提供了非侵入性治疗选择。
7 VNAR的临床用人源化
由于VNAR与人类抗体可变区序列同源性低，其人源化比骆驼VHH更具挑战。成功的人源化需要在降低免疫原性的同时，保持其独特的结构、稳定性和结合活性。首例人源化VNARhuE06的成功表明这是可行的，但仍是当前研究的重点和难点。
8 结论
VNAR作为一种新兴的生物技术工具，凭借其独特的物理化学和结构特性，在诊断、治疗等多个领域展现出巨大潜力。尽管在人源化和半衰期延长等方面仍面临挑战，但随着展示技术、库构建和工程化策略的不断进步，VNAR有望引领下一代生物药物的开发，为现代医学填补关键空白。
