《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Sensitive, specific, and rapid on-site detection of calf diarrhea pathogens using the RPA-CRISPR/Cas 12a assay
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本综述系统介绍了一种新型RPA-CRISPR/Cas12a检测技术，该技术可在50分钟内同步检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛冠状病毒（BCoV）、牛轮状病毒（BRV）和产肠毒素大肠杆菌（ETEC）四种犊牛腹泻病原体，检测灵敏度达10拷贝/μL，具备操作简便、闭管防污染等优势，为犊牛腹泻的现场精准防控提供了突破性技术方案。
引言
犊牛腹泻是新生犊牛最常见的胃肠道疾病，通常发生于出生后一个月内，对全球养牛业造成重大经济损失。主要病原体包括牛轮状病毒（BRV）、牛冠状病毒（BCoV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和产肠毒素大肠杆菌（ETEC）等。现有诊断方法在灵敏度、特异性、操作简便性和检测速度等方面存在局限，亟需开发适用于现场应用的快速检测技术。
材料与方法
研究团队通过NCBI数据库获取BVDV（5’-UTR区）、BCoV（N区）、BRV（VP7区）和ETEC（STa区）的保守序列，构建重组质粒作为标准模板。采用TwistAmp?Basic试剂盒在39°C下进行重组酶聚合酶扩增（RPA），反应体系包含29.5μL反应缓冲液、各病原体特异性引物及模板DNA。随后将RPA产物加入含LbaCas12a蛋白、crRNA和ssDNA荧光报告探针（5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’）的CRISPR/Cas12a体系，于39°C反应30分钟，通过荧光强度判定结果。
结果
优化后的RPA-CRISPR/Cas12a体系采用20μL反应体积、500 nM ssDNA报告探针、50 nM Cas12a和0.5 μM crRNA。灵敏度实验显示该方法可稳定检测低至10拷贝/μL的病原体DNA5至10拷贝/μL的荧光信号梯度增强">。特异性验证表明该方法与牛副流感病毒3型（BPIV-3）、牛疱疹病毒4型（BoHV-4）等无关病原无交叉反应。对59份临床样本的检测显示，与qPCR相比，该方法对BCoV、BRV和ETEC的检测灵敏度均达100%，对BVDV为81.8%，特异性均为100%，Kappa一致性达0.88-1.00。
讨论
本研究首次将RPA与CRISPR/Cas12a技术整合于单管反应体系中，通过双层结构设计实现闭管检测，有效避免气溶胶污染。该技术将检测时间缩短至50分钟，且无需复杂仪器，特别适用于牧场现场诊断。虽然BVDV检测灵敏度略低于qPCR，但与其他研究结果一致，未来可通过扩大样本量和优化crRNA设计进一步提升性能。该技术为犊牛腹泻病原体的多重检测提供了新范式，后续可结合Cas13系统实现RNA直接检测，拓展其在动物疫病监测中的应用前景。
