《Frontiers in Microbiology》：Gut microbiota in dysmenorrhea: causal evidence from Mendelian randomization and microbial-targeted intervention validation
1 Introduction< /h>
痛经是一种全球性妇科疾病，特征为周期性下腹痛、性交痛、月经不调和月经过多，影响超过40%的育龄妇女和高达94%的青少年。约三分之一患者因症状缺勤或辍学，且可能面临更高不孕风险。根据是否伴有盆腔器质性病变，痛经分为原发性和继发性两类。
痛经的发病机制复杂且多因素参与。除公认的前列腺素（PGs）过度生成外，还包括炎症反应、疼痛敏化、雌激素优势及孕激素抵抗等现象。非甾体抗炎药（NSAIDs）通过抑制PGs分泌缓解症状，口服避孕药（OCs）可调节雌激素和孕激素水平。中医药（TCM）因其多成分、多靶点、多通路作用特点，在临床应用中显示出显著疗效，但其机制仍需深入探索。
新近研究表明肠道菌群失调与多种疼痛综合征相关，在痛经中主要通过肠-脑轴疼痛调节、炎症反应及雌激素代谢组（estrobolome）介导。临床研究揭示子宫内膜异位症患者与健康女性肠道菌群组成存在显著差异，粪便微生物移植（FMT）和益生菌干预在痛经动物模型中显示出调节菌群、减轻炎症和缩小病灶的效果。因此，肠道菌群重构正成为痛经治疗新策略。
然而，观察性研究易受饮食、生活方式和全身性炎症等混杂因素影响，难以直接推断因果关系。孟德尔随机化（MR）利用遗传变异作为工具变量，可有效减少混杂和反向因果干扰，提供更可靠的因果证据。既往MR分析已证实肠道菌群与痛经病理相关的炎症因子（如IL-6、TNF-α）存在因果关系，但尚未有研究采用双向MR阐明痛经与肠道菌群失调的因果方向。
本研究通过双向两样本MR分析明确痛经与肠道菌群的因果关系，并建立PDM大鼠模型，比较布洛芬和文 Jing 止痛汤（WJZTD，源于《金匮要略》温经汤）的干预效果。通过表征肠道微生物组变化、评估干预后菌群恢复情况及进行功能预测相关性分析，旨在揭示药物与中药疗法的作用机制差异，重点探讨TCM的多靶点、通路驱动作用。
2 Materials and methods< /h>
2.1 Study design< /h>
采用两样本MR分析，以单核苷酸多态性（SNPs）为工具变量（IVs）评估痛经与人类肠道微生物组的潜在因果关系。研究框架包括遗传数据分析与动物实验验证两部分。
2.2 Source of data< /h>
痛经的基因组关联研究（GWAS）汇总数据来自IEU Open GWAS数据库（5,734名东亚人群，ebi-a-GCST006636）。肠道菌群211个分类群数据源自18,340名参与者的研究（Kurilshikov et al., 2021）。所有数据集均获相关伦理委员会批准。
2.3 Data filtration and IVs selection< /h>
筛选基因组显著SNPs（前向MR：< i>P< /i> < 5 × 10–8< /sup>；反向MR：< i>P< /i> < 1 × 10–5< /sup>）。排除主要组织相容性复合体（MHC）区域变异、回文SNPs及次要等位基因频率（MAF）<1%的位点。通过PLINK聚类（连锁不平衡阈值r2< /sup> < 0.001，窗口10,000 kb）识别独立SNPs。仅保留F统计量>10的工具变量以确保稳健性。所有分析均遵循MR三大核心假设。
2.4 Bi-directional two-sample MR analyses< /h>
2.4.1 Primary analysis< /h>
使用TwoSampleMR R包进行双向两样本MR分析。主要因果估计采用逆方差加权（IVW）法，辅以MR-Egger、加权中位数和加权模式法。结果显著性标准为IVW < i>P< /i> < 0.05且IVW与MR-Egger估计方向一致。显著结果以比值比（OR）和95%置信区间（CI）表示。反向MR分析以肠道菌群显著相关SNPs为IVs评估对痛经的因果效应。
2.4.2 Sensitivity analysis< /h>
通过MR-Egger截距检验评估水平多效性，Cochran’s Q统计量检验工具变量异质性。留一法（LOO）分析识别单个SNPs对整体因果估计的影响。所有分析使用R软件（4.4.3版）完成。
2.5 Animals, feeding, and treatment< /h>
动物实验经南京中医药大学实验动物伦理委员会批准（ACU211205），遵循ARRIVE指南。20只雌性SD大鼠（6-8周龄，体重160 ± 20 g）饲养于无特定病原体（SPF）环境（温度19-25°C，12 h光暗循环，湿度40%-70%），自由饮食饮水。
2.6 Primary dysmenorrhea (PDM) rat modeling procedures< /h>
适应性饲养7天后，通过阴道涂片筛选规律4天动情周期大鼠。随机分为对照组、PDM模型组、布洛芬组和WJZTD组（每组< i>n< /i> = 5）。参照经典方法，模型组、布洛芬组和WJZTD组皮下注射苯甲酸雌二醇后腹腔注射催产素（OT）诱导痛经，对照组同期注射生理盐水。第13天起，布洛芬组和WJZTD组分别灌胃布洛芬（0.07 g·kg–1< /sup>）或WJZTD（12.15 g·kg–1< /sup>），对照组和模型组给予等量生理盐水。第24天最终诱导后，麻醉大鼠采集主动脉血，处死后取血清、子宫组织和肠内容物液氮冻存。
2.7 Writhing response assessment< /h>
OT注射后记录首次扭体潜伏期和30分钟内累计扭体评分（0-3分标度）。所有评估由不知分组的研究者进行。
2.8 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)< /h>
采用商业ELISA试剂盒检测血清PGF2α< /sub>浓度。
2.9 Hematoxylin-eosin (HE) staining< /h>
子宫组织4%多聚甲醛固定后石蜡包埋，5 μm切片行HE染色，光镜观察组织形态。
2.10 Extraction of fecal DNA and 16S rRNA analysis< /h>
肠内容物提取总DNA后，扩增细菌16S rRNA基因V3-V4区（引物341F/806R）。PCR产物纯化后Illumina TruSeq平台建库测序。原始序列质控后获得扩增子序列变异（ASVs）或操作分类单元（OTUs）。使用QIIME2计算α多样性（7种指数）和β多样性，R软件可视化。LEfSe分析识别组间差异分类群，PICRUSt2基于MetaCyc数据库进行功能预测。
2.11 Correlation analyses< /h>
分析肠道菌群与疼痛参数（PG水平、扭体评分、扭体潜伏期）的Spearman相关性（< i>P< /i> < 0.05且|ρ| > 0.4为显著），必要时进行错误发现率（FDR）校正。比较布洛芬与WJZTD组菌群-疼痛相关性模式差异。
2.12 Statistical analysis for < i>in vivo< /i> experiments< /h>
GraphPad Prism 8.0.1软件进行单因素或双因素方差分析（ANOVA），< i>P< /i> < 0.05为显著，结果以均值±标准差表示。
3 Results< /h>
3.1 MR analyses identify the causal association between dysmenorrhea and gut microbiota< /h>
遗传工具变量F统计量均>10，排除弱工具偏倚。IVW分析显示痛经与7个肠道菌群分类群（1纲、2目、1科、3属）存在因果关联。痛经对< i>Erysipelotrichia< /i>纲、< i>Erysipelotrichales< /i>目、< i>Erysipelotrichaceae< /i>科（OR = 1.052）及< i>Mollicutes RF9< /i>目（OR = 1.080）呈正向因果效应，对< i>Eubacterium xylanophilum group< /i>（OR = 0.922）、< i>Lachnospiraceae NK4A136 group< /i>（OR = 0.952）和< i>Roseburia< /i>（OR = 0.932）呈负向效应。后三属均属Lachnospiraceae科，该科成员可降解多糖产生短链脂肪酸（如丁酸盐），具抗炎镇痛作用。加权中位数估计与IVW方向一致，MR-Egger截距未发现水平多效性，Cochran’s Q检验无异质性，留一法分析确认结果稳健。
3.2 Reverse MR validation for causal directionality< /h>
反向MR分析中，广古菌门（Euryarchaeota）与痛经存在微弱名义关联（β = -0.409; < i>P< /i> = 0.036），但仅基于3个SNPs，统计效力不足，未能提供肠道菌群对痛经因果效应的稳健证据。
3.3 Pharmacotherapy alleviates the pain and modulates the composition of gut microbiota in PDM rats< /h>
第12天第三次OT注射后，模型组扭体评分显著升高、潜伏期缩短（均< i>P< /i> < 0.001），成功建立PDM模型。干预12天后，布洛芬组和WJZTD组扭体反应改善（评分与潜伏期均< i>P< /i> < 0.05）、血清PGF2α< /sub>水平降低（< i>P< /i> < 0.001）。HE染色显示模型组子宫平滑肌细胞紊乱、螺旋动脉充血，药物干预部分逆转病变。子宫器官指数仅对照组和WJZTD组与模型组有显著差异。
16S rRNA测序显示各组α多样性无显著差异，但β多样性分析（NMDS应力=0.128；PCA主成分1=48.9%，主成分2=27.0%）表明微生物群落结构存在显著分离。药物干预组（尤其WJZTD组）菌群谱更接近对照组，提示痛经主要改变菌群组成而非整体多样性。
3.4 Identification of signature taxa in intestinal microbiota and functional alterations prediction< /h>
模型组在科水平显示Corynebacteriaceae和Lachnospiraceae减少，Erysipelotrichaceae、Ruminococcaceae和Paraprevotellaceae增加，药物干预逆转此失调。WJZTD组Bifidobacteriaceae增加，布洛芬组Corynebacteriaceae和Staphylococcaceae升高而Bifidobacteriaceae降低。属水平模型组< i>CF231< /i>增加、< i>Corynebacterium< /i>减少，布洛芬组< i>Allobaculum< /i>减少、< i>Staphylococcus< /i>增加，WJZTD组< i>Bifidobacterium< /i>显著富集。Erysipelotrichaceae及其属< i>Allobaculum< /i>在模型组和WJZTD组均持续富集。
LEfSe分析（LDA > 2.0）显示模型组以< i>Ruminococcus< /i>为代表，布洛芬组以< i>Staphylococcus< /i>为特征，WJZTD组以< i>Bifidobacterium< /i>为主，对照组优势菌为< i>Corynebacterium< /i>、< i>Prevotella< /i>和< i>Jeotgalicoccus< /i>。功能预测显示高丰度通路主要涉及氨基酸代谢、核苷酸合成及芳香化合物降解。对比对照组与模型组、WJZTD组与模型组差异通路（< i>P< /i> < 0.05且log FC趋势相反），发现苯乙酸降解I（PWY0-321）、甲苯降解III（PWY-5181）和4-甲基儿茶酚降解（PWY-6185）三条通路可能受WJZTD调控，均与芳香氨基酸代谢衍生化物降解相关。
3.5 Correlation analysis of gut microbiota with pain indicators and differential modulation by pharmacological interventions< /h>
相关性分析显示肠道菌群与疼痛指标广泛关联（多数|ρ| > 0.6）。< i>Blautia< /i>是唯一经FDR校正后仍与扭体评分显著负相关的属，且与血清PG水平负相关、与扭体潜伏期正相关，呈现保护性疼痛调节模式。分组分析显示布洛芬组有28个显著相关性（11个涉及PG指标），符合其前列腺素通路靶向作用；WJZTD组有91个显著相关性，体现TCM多靶点调控特点，其中< i>Blautia< /i>的保护性关联仅见于该组。
4 Discussion< /h>
本研究通过MR与动物实验整合策略，证实痛经对肠道菌群（尤其Lachnospiraceae减少和Erysipelotrichaceae增加）存在因果效应，而反向因果关系不成立。痛经所致菌群失调可作为下游病理状态被干预，恢复< i>Blautia< /i>和< i>Bifidobacterium< /i>等有益菌可缓解疼痛，凸显肠道菌群调控在痛经管理中的潜力。
MR分析发现痛经遗传易感性与Lachnospiraceae三属减少相关，该科通过代谢和免疫途径参与疼痛调节，其代谢物丁酸盐在帕金森病模型中有明确镇痛作用。临床研究也提示FMT后循环丁酸盐水平升高与疼痛改善相关。动物实验中Lachnospiraceae下调与MR结果一致。反向MR除广古菌门外无稳健证据，支持菌群变化多为痛经后果而非原因，但结果可能受东亚数据集局限性和痛经亚型未分层影响。
动物实验中，布洛芬和WJZTD均有效镇痛，但菌群调节特征迥异。布洛芬组< i>Staphylococcus< /i>富集可能与NSAIDs诱导活性氧（ROS）产生和胆汁酸代谢改变相关，更反映药物副作用而非治疗机制。WJZTD组< i>Bifidobacterium< /i>增加具有抗炎作用并参与色氨酸代谢（5-羟色胺前体），与疼痛调节密切相关，且功能预测提示WJZTD调控芳香氨基酸分解代谢通路。
药物干预主要影响β多样性（群落组成）而非α多样性（丰富度），说明靶向特定菌群而非整体多样性是治疗关键。相关性分析确立< i>Blautia< /i>为保护性菌属，其减少与神经病理性疼痛风险升高相关，恢复与症状缓解相关，且其保护性关联仅见于WJZTD组，提示该中药可能通过调节< i>Blautia< /i>发挥益处。WJZTD组分中艾叶挥发油可富集Lachnospiraceae（含< i>Blautia< /i>），山药多糖可促进< i>Blautia< /i>和< i>Bifidobacterium< /i>生长，而布洛芬无此调节作用。
Erysipelotrichaceae在模型组增加且与疼痛正相关，纤维肌痛患者FMT实验也提示其致病性，但WJZTD组该科仍升高可能反映中药多组分驱动的补偿性菌群转变。
5 Conclusion< /h>
本研究证明痛经因果性改变肠道菌群组成，特别是减少Lachnospiraceae和增加Erysipelotrichaceae。在PDM大鼠模型中，布洛芬和WJZTD均缓解疼痛但产生不同菌群特征。< i>Blautia< /i>的恢复与疼痛减轻相关，是潜在治疗靶点。研究结果强调了肠道菌群调控在痛经管理中的重要性，为微生物靶向干预奠定基础。未来需多族群队列、继发性痛经模型和功能验证研究进一步阐明机制。
