《Frontiers in Immunology》：Genome-wide CRISPR/Cas9 screening identifies host factors critical for antiviral defense against equine herpesvirus type 1
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本研究通过全基因组CRISPR/Cas9筛选技术，系统鉴定出调控马疱疹病毒1型（EHV-1）复制的关键宿主因子。研究发现，敲除PLEKHG5、ALOX15、SLC35A2等10个正向选择基因可显著抑制EHV-1的DNA复制（qPCR验证）、病毒滴度（Reed-Muench法）及蛋白表达（Western blot），并延缓细胞病变效应（CPE）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）富集分析显示，这些基因富集于蛋白酶体、脂肪酸代谢等通路。该研究为开发宿主导向的抗EHV-1疗法提供了新靶点。
1 引言
马疱疹病毒1型（EHV-1）是α疱疹病毒亚科成员，为线性双链DNA病毒，基因组约150 kb，编码超过70个开放阅读框。感染后可导致马匹发热、呼吸道症状，严重时引发流产或脑脊髓炎，死亡率达30%–50%。尽管现有疫苗和抗病毒药物可部分控制疫情，但EHV-1仍频繁暴发，其免疫逃逸机制（如gC糖蛋白屏蔽中和抗体表位、pUL56蛋白降解MHC-I分子）凸显了病毒对宿主细胞的依赖性。近年来，CRISPR/Cas9技术为系统性解析病毒-宿主互作提供了高效工具，例如在HSV-1、流感病毒等研究中成功鉴定出PAPSS1、SLC35A1等关键宿主因子。本研究以易感EHV-1的BHK-21细胞为模型，通过全基因组CRISPR/Cas9筛选，旨在揭示调控EHV-1复制的宿主网络。
2 材料与方法
2.1 质粒、细胞与病毒
使用Addgene来源的SPAX2、pMD2.G质粒及小鼠双质粒CRISPR敲除库，构建靶向PLEKHG5、ALOX15等基因的LentiCRISPRv2-Puro载体。BHK-21-Cas9稳转细胞系由新疆农业大学兽医学院保存，EHV-1 XJ2015毒株以MOI=0.5感染细胞，收获病毒上清并测定滴度。
2.2 全基因组CRISPR筛选
将GeCKO库慢病毒以MOI<0.3感染BHK-21-Cas9细胞，经嘌呤霉素筛选后，用致死剂量EHV-1攻击7天，收集存活细胞。通过两轮PCR扩增sgRNA区域，Illumina HiSeq测序分析sgRNA富集/耗竭情况，MAGeCK软件鉴定正负选择基因。
2.3 功能验证
构建10个基因的敲除细胞系，CCK-8法检测细胞活性，qPCR定量病毒DNA拷贝数，Western blot分析病毒蛋白表达，镜检观察CPE动态变化。
3 结果
3.1 筛选质量评估
BHK-21-Cas9细胞中Cas9蛋白表达显著（P< 0.001），慢病毒转导效率>80%。测序数据清洁读长占比超82%，错误率仅0.02%，病毒攻击组sgRNA覆盖率降至55.74%（对照组95.21%），表明筛选压力显著。
3.2 关键宿主因子鉴定
共识别5767个负选择基因（如FOXD4、CDK20）和620个正选择基因（如PLEKHG5、ALOX15）。前10个正选择基因的sgRNA富集倍数均>2（P< 0.05）。
3.3 通路与功能富集
KEGG分析显示候选基因富集于蛋白酶体、TCA循环、胆汁酸合成等代谢通路；GO分析提示其参与突触囊泡循环、线粒体细胞色素c释放等生物过程。
3.4 基因敲除抑制病毒复制
敲除PLEKHG5等基因后，EHV-1 DNA复制量在感染12小时显著降低（qPCR，P< 0.001），病毒滴度下降超100倍，病毒蛋白表达量减少50%–80%（Western blot）。细胞活性未受影响，排除毒性干扰。
3.5 CPE缓解
Scramble对照组感染48小时出现严重CPE（细胞圆缩、脱落），而敲除组细胞形态保持完整，CPE明显延迟。
4 讨论
本研究首次通过全基因组CRISPR/Cas9筛选系统揭示EHV-1依赖的宿主因子网络。已验证的10个基因中，SLC35A2参与糖基化修饰，PSMC2调控蛋白酶体功能，PLEKHG5关联细胞骨架运输，均与疱疹病毒复制机制密切关联。筛选数据亦提示EHV-1劫持宿主能量代谢（如TCA循环）及蛋白降解系统以支持自身复制。尽管存在跨物种（鼠源库用于仓鼠细胞）及未开展回补实验等局限，但结果为宿主靶向抗EHV-1策略提供了坚实理论基础。后续需在马源细胞或活体模型中验证这些靶点的生理相关性，并评估其治疗窗口安全性。
