《Natural Products and Bioprospecting》：Discovery of pyridomycin derivatives as InhA inhibitors from actinomycetes through molecular networking and an In-House tandem mass library
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本研究针对结核分枝杆菌耐药性问题，通过分子网络与内建串联质谱库技术，从约4000株放线菌中筛选获得产吡啶霉素的链霉菌W3009，发现7个吡啶霉素衍生物（6个为新化合物）。研究证实环状衍生物4和5具有抗结核活性，而含有关键3HP-T-3PA结构域的线性衍生物无活性，为针对InhA靶点的抗结核药物研发提供了新思路。
结核病（Tuberculosis, TB）作为由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的慢性传染病，至今仍是全球范围内导致死亡的主要传染病之一，特别是在发展中国家。随着多重耐药（MDR）和广泛耐药（XDR）结核菌株的出现，结核病的防控形势愈发严峻，开发新型抗结核药物迫在眉睫。放线菌作为抗生素的重要来源，历史上为抗结核药物研发贡献了链霉素（streptomycin）、利福霉素（rifamycins）等经典药物。其中，吡啶霉素（pyridomycin）因其对结核分枝杆菌具有显著抑制活性而备受关注。与需要经过细菌酶（如KatG、EthA）激活的异烟肼（Isoniazid, INH）和乙硫异烟胺（Ethionamide, ETH）不同，吡啶霉素能够直接抑制InhA（enoyl-acyl carrier protein reductase），该酶是结核分枝杆菌分枝菌酸（mycolic acid）生物合成途径中的关键酶，也是抗结核药物研发中经过充分验证的靶点。吡啶霉素通过占据InhA的NADH辅因子和脂质底物结合位点，直接阻断酶活性，这一机制有助于规避与传统前药激活相关的耐药途径。然而，微生物次级代谢产物的分离与结构鉴定仍面临诸多挑战，尤其是复杂混合物中未知代谢物的注释工作尤为困难。
为解决上述问题，并促进新型抗结核化合物的发现，研究人员在本研究中实施了一项综合策略，结合代代谢物分析、GNPS（Global Natural Products Social Molecular Networking）分子网络技术以及自定义的内建（in-house）MS/MS谱图数据库。通过对大约4000株放线菌菌株进行筛选，研究人员鉴定出链霉菌（Streptomyces）sp. W3009为一株新的吡啶霉素产生菌。除了吡啶霉素（1）之外，还从中分离得到七个结构相关的衍生物，包括三个先前未报道的线性类似物和四个环化衍生物。所有八个化合物均共享一个保守的3-羟基吡啶甲酸–L-苏氨酸–3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸（3-hydroxypicolinic acid–l-threonine–3-(3-pyridyl)-l-alanine, 3HP–T–3PA）结构域，但在其3-甲基戊酸侧链结构上存在差异。为评估其治疗潜力，所有八个化合物（1–8）均针对表达绿色荧光蛋白（GFP）的结核分枝杆菌H37Rv（H37Rv-GFP）进行了抑制活性测试。结果表明，吡啶霉素（1）对H37Rv-GFP的最小抑制浓度（MIC）为1.08 μM，而仅有化合物4和5分别表现出6.9 μM和9.14 μM的MIC值。重要的是，三个线性衍生物尽管含有关键的3HP–T–3PA结构域，却未显示出抑制活性。这项深入的基于质谱的研究方法证明了此类技术在发现新型生物活性核心结构及其天然衍生物中的重要作用。该研究发表于《Natural Products and Bioprospecting》期刊。
本研究主要运用了以下几项关键技术：1) 基于液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS/MS）的代代谢组学分析；2) GNPS分子网络分析结合网络注释传播（Network Annotation Propagation, NAP）技术，用于可视化代谢物关系并去重复已知化合物；3) 利用Mass Frontier 7.0软件构建内建（in-house）串联质谱库并进行计算机（in silico）碎片分析；4) 核磁共振（NMR）波谱学技术（包括一维、二维NMR如HMBC、ROESY）用于化合物结构解析；5) 针对结核分枝杆菌H37Rv-GFP的体外抗结核活性测定（MIC测定）；6) 针对野生型InhA及其吡啶霉素耐药突变体InhA(D148G)的酶抑制活性测试。研究所用放线菌菌株来源于研究团队的内建（in-house）菌种库。
2.1 通过串联质谱分析从链霉菌sp. W3009中靶向鉴定吡啶霉素衍生物
研究人员采用靶向串联质谱法（MS/MS），利用Mass Frontier 7.0软件对大约4000个放线菌粗提物进行筛选，发现链霉菌sp. W3009提取物的碎片谱图与标准吡啶霉素的相似度超过99%。通过优化碰撞能量条件，获得了吡啶霉素特征性碎片离子（m/z 429, 411, 373, 207），这些碎片对应于其关键的3HP–T–3PA结构域。随后，将W3009培养物提取物的LC-HRMS/MS数据通过GNPS进行分子网络分析，并结合NAP注释。结果显示，Cluster A（被MolNetEnhancer归类为肽类相关）中的主要节点与标准吡啶霉素的分子量和碎片谱图匹配，证实了吡啶霉素的存在。该簇中的其他节点也显示出特征性碎片离子，表明其为吡啶霉素衍生物（化合物2–5）。
2.2 通过分子网络发现线性吡啶霉素衍生物
与Cluster A不同，Cluster B中的节点在GNPS分析中未被合并，但也被MolNetEnhancer归类为肽类相关。Cluster B中一个母离子为m/z 447的节点显示出m/z 429和411的碎片离子，提示其为一个保留了3HP–T–3PA结构域的较短吡啶霉素类似物（化合物6）。另外两个节点（m/z 401和403）在其MS/MS谱图中显示出特征性碎片（m/z 178和223），从而发现了另外两个衍生物（化合物7和8）。因此，Cluster B中的节点代表了保留关键3HP–T–3PA结构域的不寻常的线性吡啶霉素衍生物。通过将分子网络分析中的保留时间与总离子流色谱图中的峰进行比对，研究人员有针对性地分离了这些衍生物以进行进一步表征。
2.3 吡啶霉素衍生物的分离与结构解析
在分子网络的指导下，成功分离得到吡啶霉素（1）和七个结构相关的衍生物（2–8）。通过高分辨质谱（HRESIMS）、一维和二维核磁共振（NMR）波谱技术，并结合与文献数据或标准品对比，鉴定了这些化合物的结构。化合物1被确认为吡啶霉素。化合物2（吡啶霉素C）和3（吡啶霉素D）分别在C2-C13位具有羟基化的侧链修饰。化合物4（吡啶霉素E）和5（吡啶霉素F）的侧链结构发生改变或缺失羟基。化合物6（吡啶霉素G）、7（吡啶霉素H）和8（吡啶霉素I）被鉴定为线性衍生物，它们保留了核心的3HP–T–3PA结构域，但侧链部分发生截短、脱羧或氧化等修饰。通过改进的Mosher酯分析法确定了化合物2中C-13的立体构型为S型。
2.4 分离的吡啶霉素衍生物的推测生物合成途径
吡啶霉素（1）是通过杂合非核糖体肽合成酶/聚酮合酶（NRPS/PKS）系统组装而成的环酯肽。其12元核心环包含四个结构单元。衍生物4可能使用了来源于亮氨酸的α-酮戊酸，而吡啶霉素本身使用了来源于异亮氨酸的α-酮-β-甲基戊酸，这归因于末端NRPS（NRPS4）较宽松的底物特异性。化合物2和3可能分别来源于1和4的C2=C13烯酰基的水合过程。线性衍生物（6–8）则被推测是PKS和NRPS4模块之间提前终止所产生的生物合成中间体，这些中间体可能经历了由3-氧脂酰ACP还原酶（Pyr2）催化的C-10位β-酮基还原反应。
2.5 吡啶霉素（1）及其衍生物（2–8）的抗结核活性
活性测试结果显示，吡啶霉素（1）对H37Rv-GFP的MIC为1.08 μM。环状衍生物4和5分别显示出6.9 μM和9.14 μM的MIC值，活性较1降低约7倍和9倍。而含有C-13位羟基的新环状衍生物2和3，以及所有线性衍生物6–8，在所测试浓度范围内未显示出显著的抗结核活性。这一结果与先前报道的具有疏水性C13取代基的合成衍生物的构效关系有所不同。有趣的是，尽管线性衍生物在体外对结核分枝杆菌无活性，但化合物8对吡啶霉素耐药突变体InhA(D148G)的酶抑制活性（86.2%）甚至优于吡啶霉素本身（77.7%），这表明其缺乏抗菌活性可能与细胞膜通透性差或体内稳定性低有关。
本研究通过基于质谱的代代谢组学方法结合分子网络技术，从链霉菌sp. W3009中分离得到七个吡啶霉素衍生物。所有分离的化合物均含有关键的3HP–T–3PA结构域。环状衍生物（2–5）在3-甲基戊酸侧链组分上与吡啶霉素（1）存在差异，但仅有衍生物4和5对结核分枝杆菌H37Rv表现出中等强度的抑制活性。相反，线性衍生物（6–8）虽然共享3HP–T–3PA结构域并在体外表现出对InhA酶的抑制活性，却未显示出抗结核活性。这种活性差异突显了化合物整体结构（如环化状态、侧链性质）对其生物学效应的重要性，可能涉及细胞通透性、代谢稳定性等因素。该研究展示了分子网络与内建质谱库相结合的策略在发现微生物来源的新颖生物活性核心结构及其衍生物方面的强大能力，为针对重要靶点（如InhA）的抗结核药物先导化合物的发现提供了新的思路和化合物实体。同时，研究结果也提示，未来通过组合生物合成或药物化学手段对这些线性吡啶霉素进行结构优化，以改善其稳定性、溶解性和生物活性，可能是一条有价值的研发路径。
