《Natural Products and Bioprospecting》：Mining anticoagulant peptides from Poecilobdella manillensis by peptidomics analysis
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本研究针对现有抗血栓药物出血风险高的问题，通过肽组学技术从药用菲牛蛭（Poecilobdella manillensis）酶解产物中筛选抗凝肽。研究发现肽段LE-11（LTKFEGVSDEE）可显著延长APTT和TT（P<0.0001），并通过小鼠模型证实其能有效缓解角叉菜胶诱导的血栓形成，中剂量（20 mg/kg）效果优于肝素对照组，为开发新型天然抗凝药物提供了候选分子。
血栓性疾病是威胁人类健康的重大公共卫生问题，心肌梗死、脑卒中等多种危重疾病均与血栓形成密切相关。然而，临床上广泛使用的抗血栓药物存在出血风险，限制了其长期应用。因此，开发高效低毒的新型天然抗凝药物成为研究热点。药用菲牛蛭（Poecilobdella manillensis）作为传统抗凝药材，其活性成分的物质基础尚不明确。
为阐明菲牛蛭抗凝活性的物质基础，研究团队采用仿生酶解技术处理菲牛蛭蛋白，通过DEAE-52阴离子交换柱和CN柱分级纯化，结合UPLC-Q-Orbitrap高分辨质谱（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）进行肽段鉴定。利用BIOPEP-UWM数据库和PeptideRanker服务器预测肽段活性，最终筛选出4个候选抗凝肽（LE-11、LR-17、SE-16、YL-17）进行体外体内验证。
关键技术方法
研究通过仿生酶解（胃蛋白酶+胰蛋白酶）处理菲牛蛭蛋白，经DEAE-52柱和CN柱分离活性组分，利用UPLC-Q-Orbitrap HRMS鉴定肽段序列，结合生物信息学工具预测活性，并通过APTT（活化部分凝血活酶时间）、PT（凝血酶原时间）、TT（凝血酶时间）和角叉菜胶诱导的小鼠血栓模型验证功能。实验动物为SPF级BALB/c小鼠（江苏大学实验动物中心提供）。
研究结果
2.1 仿生酶解产物的抗凝活性
SDS-PAGE显示酶解后大分子蛋白（>10 kDa）基本消失，血浆复钙时间（PRT）测定表明酶解产物仍保留显著抗凝活性（P<0.0001）。
2.2 酶解产物的分离纯化
DEAE-52柱分离得到PM-A、PM-B、PM-C三个组分，其中PM-A抗凝活性最强。进一步经CN柱纯化后，PM-A2和PM-A3表现出显著抗凝活性（P<0.0001和P<0.05）。
2.3 质谱分析
从PM-A2和PM-A3中鉴定出1533个分子量<3000 Da（长度<20氨基酸）的肽段，占总肽段的40.76%，符合抗凝肽的典型特征。
2.4 抗凝肽筛选与表征
BIOPEP-UWM预测显示145个肽段具潜在抗血栓活性，结合特征序列（如DEE、RGD等）筛选出26个候选肽。经PeptideRanker评分和理化性质分析，最终选定LE-11等4个肽段，毒性预测均为无毒，稳定性良好（不稳定性指数<40）。
2.5 体外抗凝活性
LE-11可显著延长APTT和TT（P<0.0001），但不影响PT，表明其通过内源性凝血途径和纤维蛋白原转化环节发挥作用。纤维蛋白平板实验显示4个肽段均无直接纤溶活性。
2.6 LE-11的体内抗血栓活性
在角叉菜胶诱导的小鼠血栓模型中，LE-11中剂量组（20 mg/kg）在24小时时尾黑化比率显著低于肝素对照组（P<0.05），组织切片显示其有效抑制血栓内纤维蛋白网络形成。
结论与意义
本研究通过肽组学策略从菲牛蛭中成功鉴定出高活性抗凝肽LE-11，其通过调控内源性凝血途径发挥抗血栓作用，且体内效果优于肝素。该研究不仅明确了菲牛蛭抗凝活性的物质基础，也为开发新型天然抗血栓药物提供了关键候选分子，发表于《Natural Products and Bioprospecting》的成果为血栓性疾病的治疗提供了新思路。
