拉曼光谱结合机器学习方法在色谱过程中实时定量BSA蛋白聚集体的开发与应用

《Biotechnology and Bioengineering》：Development of Raman Spectroscopy and Machine Learning Methods for Protein Aggregate Quantification: Application to BSA in Chromatographic Processes

本文开发了一种基于拉曼光谱和机器学习（CNN）的实时监测策略，成功实现了色谱过程中牛血清白蛋白（BSA）单体与聚集体的选择性定量。该研究通过强制降解实验和混合设计识别出酰胺I区等光谱标记物，并结合卷积神经网络（CNN）模型，克服了传统化学计量学（PLS）在低浓度和复杂环境下的精度限制，为生物制药下游过程中蛋白质聚集体的实时质量控制提供了新方法。

1 引言

蛋白聚集是生物制药过程中的关键质量属性（CQA），即使微量寡聚体也可能影响药物安全性和有效性。传统离线检测方法如尺寸排阻色谱（SEC）虽准确但存在时间延迟，无法满足实时过程控制需求。拉曼光谱因其分子特异性、快速采集能力及与水溶液的兼容性，成为过程分析技术（PAT）的理想工具。本研究以BSA为模型蛋白，旨在开发一种基于拉曼光谱的实时定量策略，结合化学计量学与机器学习方法，实现单体与聚集体的选择性监测。

2 材料与方法

2.1 实验设计

通过热应激（70°C孵育0–120分钟）在不同NaCl浓度（0–250 mM）下诱导BSA聚集，利用超高效SEC（UHP-SEC）分析聚集程度。采用拉丁超立方采样（LHS）设计独立调控蛋白浓度（0–15 g/L）和聚集体比例（25%–50%），确保光谱变化源于聚集而非浓度差异。在阴离子交换色谱（AEX）实验中，通过?kta Pure系统结合拉曼光谱实时监测洗脱过程，采集光谱经裁剪（500–3250 cm^?1）、水波段归一化（3250 cm^?1）、背景校正及Savitzky–Golay（SG）滤波预处理。

2.2 数据分析

从光谱中提取酰胺I区（1500–1800 cm^?1）质心、酰胺III比率（I₁₃₄₁/I₁₃₂₀）等标记物，并计算信噪比（SNR）评估其与聚集含量的相关性。分别建立偏最小二乘（PLS）和卷积神经网络（CNN）回归模型，通过留一批次交叉验证（LOBO）和增强测试（合成扰动数据）评估模型性能。CNN架构包含三层卷积层（核尺寸15/7/3）和全连接层，采用局部子集增强（LSA）技术生成合成光谱以提升鲁棒性。

3 结果与讨论

3.1 强制降解研究

热应激导致BSA聚集随时间增加而饱和，高阶聚集体在SEC中洗脱时间早于天然二聚体。拉曼光谱显示，酰胺I区（1651 cm^?1处α-螺旋强度降低，1673 cm^?1处β-片层强度升高）与聚集程度高度相关（SNR最高达500），而苯丙氨酸波段（990–1010 cm^?1）主要响应蛋白浓度变化。

3.2 混合研究

LHS设计验证了酰胺I区标记物在独立变化浓度与聚集比例时的线性响应，但低浓度样本（<3 g/L）因信号强度不足出现偏差。酰胺III比率及920–950 cm^?1波段比值与聚集相关性弱，标准偏差高达20%，表明酰胺I区为最可靠标记物。

3.3 结合洗脱AEX实验

3.3.1 定性光谱分析

在AEX洗脱过程中，酰胺III比率和酰胺I质心成功追踪了单体与二聚体的分离动态：梯度洗脱时标记物值随二聚体共洗脱而升高，阶跃洗脱时保持恒定。然而，低蛋白浓度（<3 g/L）和缓冲液盐梯度对水波段的影响导致光谱噪声增加，凸显了定量模型的必要性。

3.3.2 统计模型构建

CNN模型在训练集、交叉验证和外部测试中均优于PLS模型，尤其对聚集体预测的均方根误差（RMSE）降低约50%。增强测试显示CNN对未覆盖浓度组合的预测选择性更高，而数据增强（LSA）未提升性能，可能与合成光谱引入噪声有关。

4 结论

本研究证实拉曼光谱结合CNN模型可实现生物制药下游过程中蛋白聚集体的实时定量。酰胺I区标记物对聚集结构变化敏感，而CNN模型凭借高鲁棒性克服了低浓度与环境干扰的限制。未来需拓展至单克隆抗体等复杂体系，并优化预处理策略以提升工业适用性。