《Journal of Advanced Research》：Screening and identification of a novel PGAM5-specific inhibitor for attenuating multi-organ injury
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本研究针对坏死性凋亡关键调控因子PGAM5缺乏特异性抑制剂的问题，通过高通量筛选发现天然小分子化合物Plantainoside D（PD）可特异性结合PGAM5并抑制其磷酸酶活性，在急性胰腺炎、自身免疫性肝炎等多种器官损伤模型中均展现出显著保护作用，为坏死性凋亡相关疾病的治疗提供了新策略。
当细胞遭遇病原体入侵、机械创伤或毒性物质等有害刺激时，一种被称为坏死性凋亡（necroptosis）的受调控细胞死亡程序会被激活。这一过程导致损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，引发坏死和炎症的自我延续循环，造成持续的组织损伤和进行性器官功能障碍。研究表明，坏死性凋亡是多种器官损伤的共同病理机制，例如心脏缺血再灌注（I/R）损伤、急性肾损伤（AKI）、青光眼和自身免疫性肝炎（AIH）。其核心机制涉及线粒体能量衰竭、活性氧（ROS）过量产生以及RIPK1–RIPK3–MLKL信号通路的失调。值得注意的是，由缺血、毒素和感染等多种病因引起的器官损伤最终都汇聚于坏死性凋亡，这表明靶向这一通路可能为治疗多种疾病提供统一的策略。
然而，目前的药物研发主要集中在RIPK1、RIPK3和MLKL的抑制剂上。但这些候选药物面临选择性差、体内代谢稳定性不理想以及长期使用潜在毒性等局限性，导致大多数化合物仍停留在临床前阶段，成为临床转化的主要障碍。在此背景下，开发源自天然产物的坏死性凋亡抑制剂，凭借其良好的生物相容性和低毒性，为克服这些挑战、实现更安全的器官损伤治疗提供了有前景的途径。
磷酸甘油酸变位酶家族成员5（PGAM5）是一种位于线粒体外膜的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，参与多种细胞过程，包括线粒体稳态、坏死性凋亡、脂质代谢、氧化应激和免疫调节。PGAM5缺乏经典的磷酸转移酶和磷酸水解酶活性，只有在二聚化组装成十二聚体复合物时才具有酶活性。作为坏死性凋亡信号网络中的关键节点，PGAM5在多种疾病中异常高表达，包括肺纤维化、心脏I/R损伤、AIH、AKI和短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）。其病理作用与破坏线粒体稳态和诱导坏死性凋亡有关。这些发现将PGAM5定位为坏死性凋亡的关键调节因子和器官损伤的潜在治疗靶点。然而，缺乏特异性的PGAM5抑制剂继续阻碍其临床应用。
在这项发表于《Journal of Advanced Research》的研究中，研究人员首次报道了PGAM5在急性胰腺炎（AP）患者和实验性AP小鼠模型的受损胰腺腺泡细胞（PACs）中高表达，并证实了PGAM5在介导胰腺损伤中的核心作用。他们利用天然化合物的高通量筛选，鉴定出Plantainoside D（PD）作为首个天然来源的PGAM5小分子抑制剂，能有效恢复线粒体稳态并抑制坏死性凋亡。此外，PD在多种器官损伤模型中均表现出保护效应。这些发现阐明了PD抑制坏死性凋亡的机制，并凸显了其作为靶向坏死性凋亡相关器官损伤的天然化合物 therapeutic development 的潜力。
为开展本研究，研究人员运用了多项关键技术方法：利用全球性PGAM5基因敲除（PGAM5-/-）小鼠和胰腺特异性PGAM5敲低小鼠模型；基于中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）进行高通量虚拟筛选；结合分子对接、分子动力学模拟、表面等离子共振（SPR）分析、药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）实验、Pull-down实验和细胞荧光成像验证PD与PGAM5的特异性结合；通过体外磷酸酶活性测定评估PD对PGAM5酶活性的抑制；在多种 preclinical 器官损伤模型（包括Cae诱导的AP、ConA诱导的AIH、顺铂诱导的AKI、BLM诱导的肺纤维化、心脏I/R以及ph-IOP诱导的视网膜神经节细胞损伤模型）中评估PD的疗效；并进行了急性和亚慢性毒性评估以及药代动力学和组织分布研究。临床样本包括人胰腺组织芯片。
PGAM5在AP患者和实验性AP小鼠的受损腺泡细胞中显著上调
研究人员通过RNA测序发现，在Cae诱导的AP小鼠胰腺组织中，坏死性凋亡通路显著激活。整合差异表达基因、坏死性凋亡通路基因和MitoCarta3.0线粒体蛋白数据库，鉴定出九个与AP发病机制和坏死性凋亡调控相关的线粒体核心蛋白，其中PGAM5在AP小鼠中显著上调。体外实验证实，在CCK处理的PACs中，PGAM5表达增加并与线粒体应激标志物Tomm20共定位。临床样本分析显示，AP患者胰腺坏死区域PGAM5表达显著升高，且其表达水平与胰腺坏死严重程度呈正相关。
PGAM5缺陷减轻AP小鼠的胰腺损伤
通过CRISPR/Cas9技术构建的PGAM5-/-小鼠在Cae诱导的AP模型中，表现出胰腺组织水肿、炎症浸润和腺泡坏死显著减轻，血清淀粉酶和脂肪酶水平降低。胰腺特异性PGAM5敲低小鼠模型也得到了一致的结果，证实了PGAM5在胰腺损伤中的关键作用。
筛选靶向PGAM5的特异性天然小分子抑制剂
基于PGAM5晶体结构进行虚拟筛选，从TCMSP数据库中初步筛选出三个候选化合物。SPR分析显示，PD与PGAM5具有较强的结合能力（KD= 1.938 × 10-4M），而Parishin C结合较弱，NAD+则无结合。功能验证表明，PD能剂量依赖性地减少CCK诱导的PACs损伤模型中的LDH释放，保护效果优于其他候选物。
PD特异性结合并抑制PGAM5
合成生物素标记的PD探针（Biotin-PD）进行实验。Pull-down实验证实Biotin-PD能捕获内源性PGAM5，且该结合可被过量未标记PD竞争性抑制。免疫荧光显示Biotin-PD与PGAM5在细胞内共定位。DARTS实验表明PD增强了PGAM5对蛋白酶解的稳定性。体外磷酸酶活性测定显示PD浓度依赖性地抑制PGAM5的磷酸酶活性，但不影响其总蛋白表达。分子动力学模拟表明PD与PGAM5结合稳定，并减少了PGAM5二聚体间的氢键数量，提示其可能破坏PGAM5的多聚化。Western blot证实PD抑制了PGAM5的多聚体组装。脱靶实验表明PD不与其他PGAM家族成员或下游坏死性凋亡关键蛋白结合。
PD通过恢复线粒体功能障碍和阻断坏死性凋亡来保护AP胰腺损伤
在Cae诱导的AP小鼠模型中，PD治疗显著减轻了胰腺损伤，降低了血清淀粉酶和脂肪酶水平，且效果呈剂量依赖性。在PGAM5-/-的PACs中，PD的保护作用消失，证实其作用依赖于PGAM5。PD处理恢复了CCK损伤的PACs中线粒体膜电位（ΔΨm），提高了NAD+/NADH比率和ATP水平，同时降低了线粒体ROS（mtROS）积累。Western blot显示，在AP模型中，p-RIP3和p-MLKL磷酸化水平升高，而在PGAM5-/-小鼠中则显著降低，且PD处理在PGAM5 KO背景下不能进一步改变p-RIP3或p-MLKL水平。使用RIP3抑制剂GSK‘872处理后，PD的保护作用被取消，表明PD的保护作用依赖于PGAM5介导的坏死性凋亡通路调控。PD对自噬和凋亡通路关键蛋白（LC3B-II/I, Cleaved-caspase 3）无显著影响。
全身性给予PD对多种器官损伤具有广泛的保护作用
在ConA诱导的AIH模型中，PD减轻了肝坏死和血清AST、ALT水平。在顺铂诱导的AKI模型中，PD改善了肾小管损伤，降低了血清肌酐（CRE）和血尿素氮（BUN）。在BLM诱导的肺纤维化模型中，PD减少了炎症细胞浸润和胶原沉积。在心脏I/R损伤模型中，PD减小了心肌梗死面积，降低了血清LDH、心肌肌钙蛋白T（c-TnT）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平。
局部给予PD改善ph-IOP诱导的RGC损伤
在OGD/R诱导的R28视网膜前体细胞损伤模型中，PGAM5表达上调。在ph-IOP诱导的RGC损伤模型中，全身性PGAM5敲除或RGC特异性PGAM5敲低均能减轻视网膜结构损伤和RGC丢失。玻璃体内注射PD显著减轻了ph-IOP引起的RGC损伤。在体外，PGAM5敲低消除了PD对OGD/R诱导的R28细胞死亡的保护作用。
PD在小鼠体内的安全性和药代动力学特征
急性和亚慢性毒性实验表明，PD在小鼠体内未引起明显毒性反应，对主要器官功能和组织结构无不良影响。药代动力学研究显示，PD经腹腔注射后吸收迅速，在血浆中达峰时间短（Tmax= 0.15 h），消除半衰期短（T1/2= 0.26 h），但在胰腺组织中暴露量高（Cmax= 178483 ng/g），且消除较慢。在肾脏中也观察到较高的组织分布和较长的半衰期。玻璃体内注射后，视网膜组织中可检测到显著的PD浓度。
研究结论与意义
本研究成功鉴定出PD作为首个天然来源的PGAM5特异性小分子抑制剂。研究证实，PGAM5在AP等器官损伤中关键作用，其缺失可减轻损伤。PD通过直接结合PGAM5，抑制其磷酸酶活性并阻止其多聚化，从而恢复线粒体稳态、阻断坏死性凋亡，在多种器官损伤模型中展现出显著的保护效果，且安全性良好。
该研究的创新性在于：首次发现并验证了PD是PGAM5的高特异性天然抑制剂；系统阐明了PD通过靶向PGAM5调控线粒体功能与坏死性凋亡的双重保护机制；证实了PD通过全身和局部给药途径对心、肝、肾、肺、胰腺及视网膜等多种器官损伤的广泛保护作用；为坏死性凋亡相关疾病的治疗提供了新的先导化合物和策略。天然产物PD的优势在于其良好的安全性、生物相容性以及潜在的更优药代动力学特性，克服了现有合成抑制剂如LFHP-1c在溶解性、生物利用度和毒性方面的局限性。这项研究不仅为理解PGAM5在疾病中的作用提供了新的工具化合物，也展示了从天然产物库中挖掘针对难成药靶点药物的巨大潜力，为开发治疗坏死性凋亡相关多器官损伤的创新药物奠定了坚实的基础。
