一种结合了TLC（薄层色谱）和GC（气相色谱）的方法，用于对Yarrowia lipolytica中的三酰甘油进行区域特异性分析

《Journal of Chromatography B》：A combined TLC–GC approach for the regiospecific analysis of triacylglycerols in Yarrowia lipolytica

本研究优化了薄层色谱-气相色谱联用技术，用于分析工程假单胞菌（Yarrowia lipolytica）微生物油中三酰甘油（TAGs）的脂肪酸立体异构体分布。通过系统优化胰蛋白酶解、石油醚/二乙醚/乙酸溶剂系统分离及 BF3-甲醇酯化衍生化步骤，证实神经酸（NA）主要位于sn-1,3位，而γ-亚麻酸（GLA）约64.3%位于sn-2位，为快速筛查TAGs立体异构体提供了低成本高效方法。

作者：苗润泽、刘宇、王辉、于光伟、王世安、苏娟娟、韩峰

中国海洋大学医学院与药学院，青岛 266003

摘要

本研究开发了一种基于薄层色谱（TLC）与气相色谱（GC）联用的稳健且经济高效的分析方法，用于三酰甘油（TAGs）的区域特异性分析，特别适用于工程化改造的Yarrowia lipolytica产生的微生物油脂。系统优化了关键步骤，如sn-1,3位特异性脂肪酶水解、TLC分离、染色以及脂肪酸甲酯（FAME）衍生化过程。研究表明，猪胰脂肪酶是水解三酰甘油最有效且经济性的酶。采用石油醚/乙醚/醋酸（32:8:0.8, v/v）作为TLC溶剂系统，碘蒸气作为非破坏性染色方法效果最佳。BF₃-甲醇甲基化处理可避免使用甲醇-H₂SO₄时可能产生的伪影。该方法应用于产生神经酸（NA）和γ-亚麻酸（GLA）的菌株油脂后，发现神经酸几乎完全酯化在sn-1,3位，而γ-亚麻酸约有64.3%酯化在sn-2位。这种TLC-GC联用方法为快速筛查三酰甘油中脂肪酸的位点分布提供了便捷的途径。

引言

三酰甘油（TAGs）是大多数天然油脂和脂肪的主要成分。它们的生理功能和营养价值不仅取决于整体脂肪酸组成，还显著受甘油骨架上sn-1、sn-2和sn-3位脂肪酸的区域特异性分布影响[1]、[2]、[3]、[4]。例如，sn-2位的脂肪酸与sn-1/3位的脂肪酸在消化和代谢途径上存在差异，直接影响油脂的理化性质和健康效应[5]、[6]。然而，这种位点效应会因脂肪酸结构的不同而有所变化。当棕榈酸（C16:0）和n-3位长链多不饱和脂肪酸（LCPUFAs）在sn-2位酯化时，吸收效果增强[5]、[7]；相反，当长链饱和脂肪酸（LCSFAs）主要存在于sn-1/3位时，脂肪和钙的吸收会减少，粪便质地也会变得更硬[8]、[9]。因此，精确测定三酰甘油的区域异构体对于功能性脂质的定制合成至关重要。

目前定量三酰甘油区域异构体的方法主要包括酶促/化学降解[10]、[11]、色谱-质谱[12]、[13]和多维色谱[14]技术。最早的方法是使用胰脂肪酶水解结合立体特异性磷脂酶A来分析sn-1和sn-2位的脂肪酸[15]。但该方法耗时且1,2-二酰甘油中间体不稳定，容易发生酰基迁移，影响分析准确性。也有使用格氏试剂或脂肪酶生成sn-1,2(2,3)-二酰甘油，随后通过硼酸TLC分离的方法，但对于高度不饱和样品，长链多不饱和sn-1,2(2,3)-二酰甘油可能与短链sn-1,3-二酰甘油共洗脱，需要手性校正[16]。

色谱方法应用日益广泛，但往往难以完全分离所有异构体且分析耗时较长[17]。银离子HPLC（Ag⁺-HPLC）基于银离子与双键的相互作用进行分离，但对高度不饱和脂肪酸（如EPA、DHA）的分辨率较低，质谱（MS）兼容性也较差[18]、[19]、[20]。反相HPLC（RP-HPLC）按碳原子数分离，但区域异构体分辨率有限，无法通用预测手性三酰甘油的洗脱顺序[21]。质谱技术如ESI-MS/MS、电子活化解离（EAD）和ESI-MS³通过分析sn-2位特异性片段或[DAG]⁺离子提供关键的区域异构体信息[14]、[17]、[22]。对于对映体分析，使用纤维素或环糊精基相的手性HPLC-MS可实现基线分离，但依赖合成的对映体标准品[14]、[23]。多维色谱（如离线2D-HPLC结合RP-HPLC与Ag⁺-或Chiral-HPLC）通过预分离和组分收集显著提高分辨率[17]、[18]，但这些方法需要复杂的仪器、较长的分析时间和高级操作技能，限制了其在常规分析中的应用。

薄层色谱（TLC）因其简单性、低成本及能同时处理多个样品的特点，仍被广泛用于中性脂类的分离和初步定量[24]、[25]、[26]。Touchstone（1995年）的早期研究详细介绍了使用正己烷:乙醚:醋酸（70:30:1, v/v）作为流动相可有效分离TAG、DAG和MAG[27]。该方法已成功应用于多种生物系统，例如在果蝇卵发生研究中，利用石油醚/乙醚/醋酸（32:8:0.8, v/v）溶剂系统分离并定量TAG和甾醇酯的积累[28]；在Synechocystis sp. PCC 6803等蓝细菌中，也使用己烷:乙醚（90:10, v/v）流动相结合碘蒸气染色分离中性脂质[29]。

在酵母中的甘油脂代谢研究中，TLC常与生物正交标记技术结合使用。例如，基于点击化学的TLC方法用于追踪标记的甘油-3-磷酸探针在脂质中的整合[30]；还有使用己烷:乙醚:醋酸（70:30:1, v/v）分离出芽酵母中的中性脂质，并通过Coomassie Brilliant Blue染色实现清晰可视化[31]。

为了利用这些优势进行区域特异性分析，本研究优化了一种TLC–GC联用方法，用于确定工程化Yarrowia lipolytica产生的三酰甘油中sn-2位与sn-1/3位脂肪酸的分布。系统优化了脂肪酶选择、TLC条件及脂肪酸甲基化等关键步骤，从而开发出一种稳健且经济高效的分析方案，尽管该方法在区分对映体方面存在局限性。

材料与试剂

所有常用化学品和溶剂，包括甲醇、氯仿、n-己烷（HPLC级）、石油醚、无水乙醚、醋酸、硫酸、氢氧化钾、盐酸、氯化钠、磷酸二钠、硫酸钠和D-(+)-葡萄糖一水合物均购自中国上海的中国医药试剂有限公司。甲醇-三氟化硼（BF?-MeOH，约14%）购自上海Macklin公司（产品编号：

染色效果比较

我们首先比较了碘蒸气染色和Coomassie Brilliant Blue R-250染色。碘蒸气染色是一种可逆、简单、快速的方法，可控制染色时间和强度，且不会破坏中性脂质的结构（图1A）。相比之下，Coomassie Brilliant Blue R-250会产生难以清洗掉的深色背景染色。不过该染色过程耗时较长，导致条带模糊。

讨论

本研究优化了一种高效且经济可行的TLC–GC联用方法，用于确定三酰甘油中脂肪酸的区域特异性分布。系统优化表明，每一步中试剂的精心选择对准确和高效的分析至关重要。

结果证实，猪胰脂肪酶是sn-1,3位水解最有效且经济性的选择，这与其已知的特异性一致[15]、[32]。在TLC分离过程中，基于石油醚的

结论

本研究开发了一种稳健且经济可行的TLC–GC联用方法，用于三酰甘油的区域特异性分析。通过系统优化脂肪酶水解、TLC条件和衍生化步骤，确保了数据的可靠性。将该方法应用于工程化改造的Y. lipolytica油脂后，发现神经酸（主要酯化在sn-1,3位）和γ-亚麻酸（主要酯化在sn-2位）具有明显的区域特异性沉积模式。

作者贡献声明

苗润泽：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法设计、实验设计、资金申请、数据分析、概念构思。 刘宇：撰写 – 审稿与编辑、结果验证、项目管理、资金申请、概念构思。 王辉：撰写 – 审稿与编辑、结果验证、项目管理、资金申请、概念构思。 于光伟：撰写 – 审稿与编辑、结果验证、项目管理、

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。