《iMetaMed》：Oat β-Glucan and Galactooligosaccharides Influence Gallstone Formation by Modulating the Gut Microbiota, Particularly Desulfovibrionales
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本研究揭示了两种常见益生元（燕麦β-葡聚糖和低聚半乳糖，GOS）对胆结石形成的相反作用及其机制。燕麦β-葡聚糖通过增加肠道脱硫弧菌目（Desulfovibrionales）丰度，促进其代谢产物硫化氢（H2S）生成，进而激活肝脏法尼醇X受体（FXR）-小异二聚体伴侣（SHP）通路和肠道FXR-成纤维细胞生长因子15（FGF15）通路，抑制胆汁酸合成，增加胆汁胆固醇负荷和胆汁酸疏水性，最终促进胆结石形成；而GOS则通过降低Desulfovibrionales丰度发挥抑制作用。二者联用时效果相互抵消。该研究为益生元在胆结石防治中的应用提供了新的理论依据。
引言
胆结石病（Gallstone Disease, GS）是一种全球流行的消化系统疾病，成人发病率达10%-20%，其中超过90%为胆固醇型结石。胆结石的形成需要胆汁胆固醇过饱和，其病理生理机制涉及环境和遗传因素，但具体机制尚未完全阐明。近年来，肠道菌群在代谢性疾病包括胆结石中的作用日益受到关注。肠道菌群可通过产生羟基类固醇脱氢酶、7α-脱羟基酶（7α-dehydroxylase）和胆汁盐水解酶（Bile Salt Hydrolase, BSH）等干扰胆汁酸代谢，影响胆汁酸池组成。胆汁酸作为多种肠道受体（如法尼醇X受体，FXR）的内源性配体，通过作用于这些受体，肠道菌群和胆汁酸可对肝脏脂质代谢产生显著影响，这可能部分解释其与胆结石形成的关联。
燕麦β-葡聚糖（Oat β-Glucan）和低聚半乳糖（Galactooligosaccharides, GOS）是两种常见的不可消化碳水化合物，可作为益生元显著影响肠道菌群组成。燕麦β-葡聚糖在非酒精性脂肪肝病、高胆固醇血症、2型糖尿病等多种疾病中发挥积极作用，这些作用主要通过调节肠道菌群、胆汁酸和短链脂肪酸代谢及其生物吸附特性实现。GOS则被证明可显著增强肠道BSH活性以改善脂代谢紊乱，并通过调节肠道菌群、影响胆汁酸代谢和短链脂肪酸产生，缓解肠道炎症、肠屏障功能障碍和2型糖尿病。
燕麦β-葡聚糖和GOS对胆结石形成和脂质代谢的影响
动物实验表明，在致石饮食（Lithogenic Diet, LD）喂养4周后，补充燕麦β-葡聚糖（LDB组）的小鼠胆结石发生率（12/12）显著高于仅喂食致石饮食的LD组（6/12），而补充GOS（LDG组）的小鼠胆结石发生率降低（2/12）。当同时补充燕麦β-葡聚糖和GOS（LDM组）时，胆结石发生率（7/12）与LD组基本一致，表明两种益生元的作用可能相互抵消。与LD组相比，燕麦β-葡聚糖和GOS均减轻了体重增加。油红O染色和苏木精-伊红染色显示，LDB和LDG组肝脏脂滴积聚少于LD组，表明两者对肝脂肪变性有保护作用，但这种效应在两种多糖同时添加时减弱。血清学检测显示，LDB和LDG组血清总胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯、乳酸脱氢酶和天门冬氨酸氨基转移酶水平较低，其中LDG组降低更明显。这些数据表明，燕麦β-葡聚糖和GOS均可缓解致石饮食诱导的脂代谢紊乱，但对胆结石形成产生相反影响，且两种益生元的作用可被抵消。
燕麦β-葡聚糖和GOS调节肠道菌群，特别是Desulfovibrionales
通过对结肠和盲肠内容物进行16S rRNA基因测序分析肠道菌群组成，主坐标分析显示LDG组与LD组微生物群落结构存在显著差异。LDB组与LD组差异不明显，但LDB组微生物聚类更分散，表明燕麦β-葡聚糖可能在LD组基础上进一步改变了微生物。线性判别分析效应大小显示，燕麦β-葡聚糖主要增加了脱硫弧菌目和颤螺旋菌目丰度；GOS与双歧杆菌目、伯克霍尔德菌目和梭菌目丰度升高相关；而乳杆菌目和弯曲菌目在LD组中更丰富。相对丰度定量分析显示，与LD组相比，Desulfovibrionales丰度在LDB组升高，在LDG组降低。LDM组丰度介于LDB和LDG组之间，总体与LD组一致，该丰度趋势与胆结石形成率一致，提示Desulfovibrionales丰度可能与胆结石风险相关。尽管颤螺旋菌目呈现相似趋势，但其丰度显著低于Desulfovibrionales，因此Desulfovibrionales可能在介导这两种益生元对胆结石发生率的影响中起关键作用。LDG组双歧杆菌目、伯克霍尔德菌目和梭菌目水平显著升高，提示它们可能在预防胆结石发展中起作用。
燕麦β-葡聚糖和GOS通过调节肠道菌群影响胆汁酸谱
Desulfovibrionales将牛磺酸等底物降解为H2S，而H2S是7α-脱羟基细菌的重要生长因子。肠道细菌7α-脱羟基化作用将初级胆汁酸如鼠胆酸、鹅脱氧胆酸和胆酸转化为次级胆汁酸如ω-鼠胆酸、石胆酸和脱氧胆酸。检测盲肠胆汁酸发现，燕麦β-葡聚糖和GOS均显著改变胆汁酸谱。与LD组相比，LDB组石胆酸和脱氧胆酸显著升高，而LDG组则降低，表明两者可通过改变Desulfovibrionales丰度影响肠道细菌7α-脱羟基化活性。此外，LDG组牛磺鼠胆酸、γ-鼠胆酸和β-鼠胆酸水平升高，而LDB组鹅脱氧胆酸和α-鼠胆酸水平增加。胆囊胆汁中胆汁酸谱也发生显著改变：LDB组胆酸和脱氧胆酸水平高于LD组，而LDG组降低。LDG组α-鼠胆酸、牛磺-α-鼠胆酸、β-鼠胆酸、牛磺-β-鼠胆酸及其他几种结合胆汁酸水平高于其他组。由于脱氧胆酸和胆酸比β-鼠胆酸、α-鼠胆酸和牛磺结合胆汁酸疏水性更强，这些组成变化表明LDB组胆汁酸疏水性高于LD组，而LDG组疏水性较低。增加的疏水性促进胆固醇从胆汁中沉淀，从而促进胆结石形成。
燕麦β-葡聚糖和GOS调节肝脏胆固醇和胆汁酸代谢
为阐明燕麦β-葡聚糖和GOS影响胆结石形成的肝脏代谢机制，评估了肝脏样本中胆固醇和胆汁酸代谢的关键调节因子。在肝细胞中，胆汁酸合成依赖于细胞色素P450酶超家族对胆固醇的氧化，包括“经典”途径和“替代”途径。燕麦β-葡聚糖抑制编码所有四种胆汁酸合成酶的基因表达，尤其是CYP8B1和CYP7A1；而GOS显著升高CYP7A1和CYP8B1表达。蛋白水平也显示相应变化。LD组CYP7B1和CYP27A1的mRNA表达最高，表明致石饮食可能主要通过抑制经典途径诱导胆结石形成，而替代途径可能因胆固醇积聚被进一步激活作为代偿反应。LDB组CYP7B1和CYP27A1 mRNA表达持续低于LD组，表明燕麦β-葡聚糖可能通过抑制胆汁酸合成的经典和替代途径促进胆结石形成。LDG组CYP7B1和CYP27A1表达水平与LD组相当。LDM组所有四种酶的表达介于LDB和LDG组之间，进一步表明两种益生元的作用可被抵消。
主要胆汁酸转运调节因子也发生变化：胆汁盐输出泵和钠-牛磺胆酸共转运多肽的mRNA表达在LDB组下调，在LDG组上调。BSEP蛋白变化一致。在胆汁淤积中，肝脏有机溶质转运蛋白亚基α/β诱导胆汁酸外排至体循环，OSTα和OSTβ在LDB组较其他组升高，这可能是胆汁酸代谢紊乱的结果。肝脏胆固醇转运体ABCG5和ABCG8表达在LDB组升高，在LDG组降低，ABCG5/G8的上调促进胆固醇分泌到胆汁中，增加胆结石形成风险。参与胆固醇逆向转运的ABCA1和ABCG1在LDG组表达升高，可能有助于GOS介导的肝胆固醇水平降低和胆结石预防。LDG组3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶水平升高，HMGCR是胆固醇生物合成的限速酶，因此GOS可能改善致石饮食诱导的胆固醇代谢紊乱并恢复体内胆固醇合成。负责肝细胞磷脂转运的ABCB4在LDG组mRNA表达升高，也有助于GOS介导的胆汁疏水性降低。
燕麦β-葡聚糖和GOS通过肝脏FXR-SHP和肠道FXR-FGF15通路调节胆汁酸代谢
现有研究表明，肠道Desulfovibrionales将硫酸盐还原为H2S，后者通过门静脉进入肝脏后激活肝脏FXR，从而通过上调肝脏SHP表达和下调关键胆汁酸合成酶抑制胆汁酸合成。与LD组相比，LDB组血清H2S水平升高，而LDG组降低，这与Desulfovibrionales丰度变化平行。相应地，肝脏FXR和SHP的mRNA表达在LDG组较低，在LDB组较高；肝脏FXR蛋白表达也呈现相似趋势。这些发现表明，燕麦β-葡聚糖和GOS通过影响Desulfovibrionales丰度及其代谢产物H2S，通过肝脏FXR-SHP信号通路控制胆汁酸产生。
肠道胆汁酸以不同方式影响肠道FXR受体：脱氧胆酸、石胆酸和鹅脱氧胆酸被认为是高亲和力FXR激动剂，而牛磺-β-鼠胆酸和β-鼠胆酸是最有效的拮抗剂。肠道胆汁酸测量表明，LDB组鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸和石胆酸水平升高，而LDG组这些胆汁酸水平较低；此外，LDG组β-鼠胆酸、γ-鼠胆酸和牛磺-β-鼠胆酸水平升高，而LDB组降低。因此，燕麦β-葡聚糖和GOS可能对肠道FXR产生不同影响。正如预测，肠道FXR的mRNA和蛋白表达在LDG组较低，在LDB组较高。激活的肠道FXR促进FGF15分泌并抑制胆汁酸合成酶。与FXR表达变化一致，血清FGF15浓度在LDB组较高，在LDG组较低。因此，肠道FXR-FGF15通路也是两种益生元作用的核心。
为进一步验证FXR的参与，进行了动物实验。当LDB小鼠给予FXR激动剂DY268时，燕麦β-葡聚糖对胆结石形成的促进作用被抵消；同样，当LDG小鼠给予FXR抑制剂GW4064时，GOS对胆结石发展的抑制作用也被减弱。这些发现进一步证实两种益生元通过FXR-SHP和FXR-FGF15通路介导其作用。
燕麦β-葡聚糖和GOS的作用可通过粪便微生物群移植转移
为验证这些益生元通过调节肠道菌群影响胆结石发展，进行了粪便微生物群移植。经过4周微生物群定植后，移植燕麦β-葡聚糖相关微生物群的小鼠胆结石发生率仍高于移植LD微生物群的小鼠；而移植GOS相关微生物群的小鼠胆结石发生率降低。移植后小鼠体重变化和肝脏脂肪变性减轻效果与直接补充益生元组相似。16S rRNA分析显示，FMT显著影响受体肠道菌群，微生物群组成变化与直接补充燕麦β-葡聚糖和GOS观察到的相似。微生物丰度定量分析结果与之前发现基本一致， notably，Desulfovibrionales丰度在FMT.B组显著升高，在FMT.G组降低。四种胆汁酸合成酶的mRNA表达在各组间呈现类似变化：燕麦β-葡聚糖相关微生物群显著下调CYP7A1、CYP8B1、CYP7B1和CYP27A1水平，而GOS相关微生物群导致其表达上调。此外，血清H2S浓度和肝脏FXR mRNA表达水平在FMT.B组仍升高，在FMT.G组降低；血清FGF15浓度和肠道FXR mRNA表达水平也呈现相同趋势。这些数据共同表明，这两种益生元对胆结石形成和脂质代谢的影响确实是通过调节肠道菌群介导的。
讨论
多项研究已证实燕麦β-葡聚糖和GOS通过影响肠道菌群调节脂质代谢的作用，但它们对胆结石形成的影响尚不清楚。本研究首次发现燕麦β-葡聚糖可促进胆结石发展，而GOS可预防之。更有趣的是，同时给予两种益生元时这种效应被中和，表明它们的机制可能重叠。后续研究揭示，两种益生元主要通过改变Desulfovibrionales丰度影响胆结石形成。
详细机制包括：富含Desulfovibrionales的肠道菌群增强肠道7α-脱羟基化酶活性以合成更多脱氧胆酸和石胆酸；产生H2S并通过肝脏FXR-SHP信号进一步抑制肝脏胆汁酸产生；肠道中脱氧胆酸、石胆酸和鹅脱氧胆酸增加以及β-鼠胆酸和牛磺-β-鼠胆酸减少共同通过肠道FXR-FGF15级联抑制肝脏胆汁酸产生；通过肠肝循环，更多疏水性脱氧胆酸和胆酸以及更少亲水性β-鼠胆酸、牛磺-β-鼠胆酸和牛磺-α-鼠胆酸进入胆汁。这些共同导致肝脏胆固醇过载和胆汁酸疏水性增加，进而促进胆固醇从胆小管分泌到胆汁中，导致胆结石发展。
燕麦β-葡聚糖作为多种疾病的治疗选择，其作用主要依赖于调节和恢复肠道菌群。先前研究未证明其与Desulfovibrionales的关联，这可能主要由于其在健康肠道环境中基线分类群丰度相对较低。致石饮食喂养的小鼠中Desulfovibrionales丰度升高已有报道，这些观察结果可能解释本研究中燕麦β-葡聚糖诱导的Desulfovibrionales丰度增加。燕麦β-葡聚糖对脂质代谢紊乱有积极影响，补充燕麦β-葡聚糖可降低血清和肝脏脂肪变性中的胆固醇水平，同时伴随肝脏Cyp7a1下调和Fxr上调，与本实验结果一致。胆固醇向胆汁酸转化减少理论上会诱导肝脏胆固醇积聚，但在参考研究和本研究中均未观察到这种效应，这种差异可能通过以下解释：燕麦β-葡聚糖通过在肠道形成高粘度环境吸附胆固醇和胆汁酸；补充燕麦β-葡聚糖后胆固醇转运体Abcg5和Abcg8显著上调，促进胆固醇从肝细胞分泌到胆汁中；此外，燕麦β-葡聚糖补充抑制了从头胆固醇生产，如HMGCR表达显著降低所示。这些可能共同解释这一现象。
GOS作为一种优良的益生元被广泛使用，其既定功能包括选择性刺激益生菌增殖。几项研究表明，GOS通过其益生元活性调节脂质代谢，从而改善肝脏脂肪变性、肥胖和高胆固醇血症。本研究还观察到GOS降低了Desulfovibrionales丰度。然而，这种通过影响肠道菌群的免疫调节作用在炎症性肠病和其他炎症状况中得到了更广泛的表征。
胆石症患者常表现出肠道菌群失调，许多研究比较了胆结石个体和无胆结石个体的肠道菌群组成，揭示了特定微生物类群的变化。首先，Desulfovibrionales和颤螺旋菌在胆结石个体中显著升高，支持燕麦β-葡聚糖通过调节肠道菌群促进胆结石形成的作用。同时，胆石症患者中乳杆菌和链球菌丰度升高已有报道，这与LD组乳杆菌丰度最高一致。此外，胆结石个体中双歧杆菌和Akkermansia丰度降低，本研究中GOS补充增加了这些有益菌群的丰度，进一步支持GOS通过调节肠道菌群抑制胆结石形成的假设。
燕麦β-葡聚糖是一种不能被人体消化系统直接降解的多糖。到达结肠后，燕麦β-葡聚糖可被特定多糖降解菌发酵，产生各种短链脂肪酸，主要是乙酸。乙酸可直接作为Desulfovibrionales的碳源，刺激其增殖。短链脂肪酸水平定量分析证实了这一假设，显示燕麦β-葡聚糖和GOS均显著影响短链脂肪酸谱。值得注意的是，乙酸浓度在LDG组降低，在LDB组升高，表明短链脂肪酸，特别是乙酸，在燕麦β-葡聚糖和GOS对Desulfovibrionales丰度的差异效应中起核心作用。此外，某些产氢菌能够直接利用燕麦β-葡聚糖并增强氢气生产，氢气作为Desulfovibrionales的电子供体，进一步促进其丰度增加。
GOS作为一种益生元，由通过β-(1→4)和β-(1→6)糖苷键连接的半乳糖单体组成。它可被双歧杆菌和乳杆菌有效代谢，这些细菌表达特定的β-半乳糖苷酶。这些有益菌的增殖可能通过竞争营养和改变肠道环境间接抑制潜在病原体生长。这也与我们的结果一致；GOS的补充确实增加了双歧杆菌目的丰度。此外，GOS发酵过程中有限的氢气产生也可能抑制Desulfovibrionales的生长。燕麦β-葡聚糖和GOS共同补充显示Desulfovibrionales丰度与LD组相似，表明它们对Desulfovibrionales的个体效应可能相互抵消。一个可能的解释是，GOS结构比燕麦β-葡聚糖更简单，更易被肠道双歧杆菌和乳杆菌利用和发酵。这些细菌属也是燕麦β-葡聚糖降解的核心。因此，这种结构差异可能导致燕麦β-葡聚糖的降解和功能延迟。此外，GOS发酵产生大量乳酸，降低肠道pH值。由于Desulfovibrionales对酸性条件敏感，其生长可能被直接抑制。此外，pH降低也抑制了产氢菌的功能，进一步减弱燕麦β-葡聚糖的刺激作用。这些因素可能共同解释两种益生元联合补充时Desulfovibrionales丰度未改变的原因。
通过影响Desulfovibrionales丰度，燕麦β-葡聚糖和GOS改变了血清H2S水平和胆汁酸谱，从而通过肠道FXR-FGF15和肝脏FXR-SHP级联调节胆结石形成。当两种益生元同时给药时，相关代谢物产生和关键调节因子水平介于单独添加每种益生元之间，进一步支持其潜在作用机制。
燕麦β-葡聚糖和GOS在多项临床研究中被广泛研究其对糖脂代谢的调节作用。根据一项2016年的研究，每天补充0.4克燕麦β-葡聚糖可使碳水化合物消耗后餐后血糖峰值降低20%。此外，每天补充2.9克燕麦β-葡聚糖持续4周可使低密度脂蛋白和总胆固醇降低9%。值得注意的是，这些研究中使用的剂量显著低于本实验模型中的给药剂量，表明较高剂量可能是本研究中胆结石形成的一个因素。关于GOS，一项研究表明补充GOS可显著降低超重志愿者的总胆固醇和甘油三酯水平。在另一项临床试验中，每天补充6克GOS也降低了孕妇的总胆固醇和甘油三酯水平，尽管不具统计学显著性。总的来说，现有证据表明GOS的有效剂量低于燕麦β-葡聚糖，可能归因于其更简单的分子结构。这一发现也为两种益生元在人类应用中的给药策略提供了潜在的实践指导。
富含Desulfovibrionales的肠道菌群显著影响胆汁酸谱。通过将硫化合物还原为H2S，Desulfovibrionales促进7α-脱羟基细菌增殖，增加石胆酸和脱氧胆酸合成。一方面，这种增加使胆汁酸池更具疏水性，从而驱动胆固醇沉淀和胆结石形成。另一方面，次级胆汁酸作为强肠道FXR受体激动剂，显著改变胆汁酸稳态。β-鼠胆酸和α-鼠胆酸经过7α-脱羟基化生成ω-鼠胆酸，GOS给药降低了Desulfovibrionales丰度并抑制了7α-脱羟基化；因此，LDG组牛磺鼠胆酸和β-鼠胆酸水平升高。鹅脱氧胆酸主要通过“替代”途径合成。LDG组鹅脱氧胆酸水平低于LDB组；然而，CYP7B1和CYP27A1的mRNA和蛋白表达在LDB组较低。在啮齿动物肝脏中，大多数鹅脱氧胆酸被转化为鼠胆酸；因此，LDB组低牛磺鼠胆酸和鼠胆酸水平及高鹅脱氧胆酸水平表明燕麦β-葡聚糖可能阻止鹅脱氧胆酸转化为鼠胆酸，而GOS增强这种代谢转变；然而，具体机制需要进一步研究。FXR可直接影响胆结石发展。在所有胆汁酸中，鹅脱氧胆酸是最有效的肠道FXR激动剂。然而，牛磺-β-鼠胆酸和β-鼠胆酸是最强的抑制剂。总的来说，胆汁酸中的这些组成变化可能提供一
