《Metabarcoding & Metagenomics》：?Applying flukeprint environmental DNA to detect skin-associated bacteria from free-ranging West Coast Transient killer whales
Orcinus orca rectipinnus
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本文推荐研究人员针对自由生活的西海岸过境型虎鲸（WCT）皮肤健康评估难题，创新性地应用flukeprint eDNA（环境DNA）采样技术，成功检测到其皮肤相关独特细菌类群（如Chryseobacterium、Shewanella等），并通过功能通路预测揭示其与皮肤代谢（如氧化还原酶、水解酶）的关联。该非侵入性方法为濒危鲸类皮肤微生物组研究及健康监测提供了新范式。
在全球范围内，船只撞击、渔网缠绕和海洋污染等人为活动正日益威胁着鲸类动物的生存。这些威胁不仅直接损伤鲸类皮肤，还通过引发疾病或增加对慢性细菌、病毒或真菌感染的易感性来损害其健康。对自由生活的鲸类皮肤微生物群落进行特征分析，为评估和建立皮肤状况的基线趋势提供了一种重要手段。然而，传统的皮肤微生物数据收集主要依赖活检取样，这种方法具有轻微侵入性，且仅能代表皮肤的一小部分表面积。对于濒危或难以接近水面的鲸类物种而言，活检取样并非理想选择。因此，开发和应用非侵入性方法来获取鲸类微生物组和种群遗传学信息变得至关重要。
在此背景下，一项发表在《Metabarcoding》上的研究进行了创新性探索。该研究旨在应用一种名为“尾迹环境DNA（flukeprint environmental DNA, eDNA）”的非侵入性采样技术，来检测自由生活的西海岸过境型虎鲸（West Coast Transient killer whales, Orcinus orca rectipinnus，简称WCT）皮肤相关的细菌群落。研究人员重点关注三个核心问题：能否从虎鲸尾迹eDNA样本中检测到独特的细菌；这些独特细菌是否可能通过功能通路评估与皮肤相关；以及尾迹样本中检测到的细菌与通过侧向图像评估的个体鲸皮肤完整性之间是否存在关联。
为了回答这些问题，研究人员在加利福尼亚州和不列颠哥伦比亚省（B.C.）海域对WCT种群进行了采样。他们采用机会性采样方式，在虎鲸个体进行终末潜水后30秒至1分钟内，立即在其产生的尾迹（flukeprint，即鲸下潜后水面留下的扰动水团）旁采集海水样本作为eDNA来源。同时，采集邻近海域的海水样本作为环境对照。此外，研究团队还拍摄了每头采样鲸的高质量左右侧向照片，用于后续的皮肤完整性视觉评估。所有eDNA样本在采集后数小时内进行过滤，提取DNA后，针对16S rRNA基因的V4/V5区域进行扩增子和高通量测序。获得的序列数据使用MetaWorks流程进行处理，包括序列拼接、去噪、生成精确序列变体（Exact Sequence Variants, ESVs）和分类学注释。生物信息学分析包括α和β多样性分析、群落结构比较（使用主坐标分析PCoA和Bray-Curtis相异度）、微生物溯源分析（使用FEAST工具）以及功能预测（使用PICRUSt2工具预测宏基因组功能通路）。另一方面，对采集的鲸类图像，使用ImageJ软件将鲸体侧可见表面区域（Visible Surface Area, VSA）划分为四个区域（背鳍、前部、侧中部、尾柄），并系统评估和测量了皮肤病变（如灰色斑块、灰色靶状斑等）的面积百分比和疤痕指数。最后，通过统计模型（如线性模型、PERMANOVA）分析了细菌多样性（ESV丰富度和属水平丰富度）与地理区域、采样月份、鲸年龄、鲸性别以及皮肤病变百分比等因素之间的关系。
样本收集与处理
研究在加利福尼亚州蒙特雷湾地区和不列颠哥伦比亚省南部萨利希海共收集了39个eDNA样本，包括24个虎鲸尾迹样本和15个海水对照样本。样本采集后尽快过滤，DNA提取使用DNeasy Blood & Tissue Kit。16S rRNA基因扩增子测序在加拿大不列颠哥伦比亚大学的高通量生物学平台完成。测序数据经过质量控制、去噪和分类学注释，生成ESV表用于下游分析。
细菌类群的检测
研究结果显示，在尾迹样本和海水对照中检测到的主要细菌门包括变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和蓝藻门（Cyanobacteria）。总体而言，尾迹样本检测到的细菌ESV丰富度（1870个ESVs）和属水平丰富度（417个属）均高于海水对照样本（1514个ESVs，359个属）。不列颠哥伦比亚省采样点的细菌ESV丰富度高于加利福尼亚州。
海水对照与尾迹样本中细菌类群的比较
主坐标分析（PCoA）显示，尾迹样本和海水对照样本的细菌群落结构存在一定分离，但差异未达到统计显著性。然而，在属水平上，有117个细菌属为尾迹样本所独有，而海水对照独有的属为51个。对采集的尾迹样本进行配对分析发现，所有尾迹样本均含有其对应海水对照中未检测到的独特细菌属。微生物溯源分析（FEAST）进一步表明，尾迹样本中的细菌大部分（59%-100%）来源于周围海水，但仍有相当一部分（0%-41%）来源于“未知”源，推测可能来自鲸皮肤。
个体鲸的细菌群落
研究发现，16个尾迹样本（89%）检测到了独特的细菌科。这些独特的细菌类群在个体间和地理区域间存在差异。例如，在加利福尼亚州样本中独有Pasteurellaceae等科，而在不列颠哥伦比亚省样本中，Dysgonomonadaceae等科在多个个体中共享。细菌群落的差异主要受地理区域的影响，解释了47%的变异。鲸的年龄和性别也对群落结构有一定影响。
皮肤病变和疤痕
对15头WCT的皮肤图像分析显示，灰色斑块是最常见的皮肤病变类型。皮肤病变的覆盖率和疤痕指数在个体间和身体不同区域（背鳍、前部、侧中部、尾柄）存在差异，其中侧中部和尾柄区域的病变和疤痕更为明显。总体而言，加利福尼亚州样本的鲸皮肤病变百分比略高于不列颠哥伦比亚省样本。
皮肤完整性分析
统计分析表明，尾迹样本中检测到的独特细菌ESV数量与鲸的年龄和皮肤病变百分比呈负相关，即年轻个体或皮肤病变较少的个体，其尾迹中检测到的独特细菌多样性更高。而细菌属的丰富度则与地理区域、鲸性别和采样月份相关。
讨论与结论
本研究成功证明，利用非侵入性的尾迹eDNA采样方法，能够检测到西海岸过境型虎鲸皮肤相关的独特细菌类群。这些细菌中富含与皮肤环境相关的功能通路，如氧化还原酶（EC 1）、转移酶（EC 2）和水解酶（EC 3），这些酶类在微生物定植皮肤、抵抗氧化应激和降解宿主分子方面可能发挥重要作用。研究发现，鲸的皮肤细菌群落受到地理区域、采样时间、个体年龄和性别等多种因素的影响。同时，皮肤健康状况（以病变百分比衡量）与皮肤相关细菌的多样性存在关联，提示尾迹eDNA有潜力作为评估鲸类皮肤健康的指标。
重要意义
这项研究的创新之处在于首次将flukeprint eDNA采样技术应用于自由生活鲸类的皮肤微生物组研究。与传统活检相比，该方法完全非侵入性，避免了对濒危物种的潜在干扰，并能获取更大体表面积的微生物信息。研究结果表明，尾迹eDNA中包含可检测的、可能来源于鲸皮肤的细菌信号，这为未来对难以进行活检采样的濒危或敏感鲸类种群（如南方居留型虎鲸）进行健康监测和生态研究开辟了新途径。通过将eDNA技术与图像分析相结合，未来有望建立更全面的鲸类个体健康评估体系。随着人工智能技术的发展，整合尾迹eDNA数据和无人机影像，可能进一步推动基于机器学习的鲸类皮肤病变自动识别和分类方法的发展，从而为海洋哺乳动物的保护和健康管理提供更强大、更高效的工具。
