《Food Science & Nutrition》：Synergistic Bioconversion of Date Palm Leaves Into Ruminant Feed by a Leopard Moth (Zeuzera pyrina L.) Gut Bacterial Consortium and Nutrient Stimulators
1 引言
全球对畜产品需求的增长以及传统动物饲料成本的上升，促使人们必须开发利用具有成本效益且营养充足的替代饲料资源。农业副产品已成为动物日粮的重要组成部分，其营养价值可通过各种加工技术得到进一步提升。在众多资源中，木质纤维素副产品如椰枣叶（DPL）在许多地区储量丰富。这些材料主要由结构性碳水化合物（即纤维素、半纤维素和果胶）组成，并以高含量的酚类化合物木质素为特征。然而，高木质素浓度和低粗蛋白（CP）含量固有地限制了木质纤维素材料在反刍动物日粮中的消化率和有效利用率。这种顽固性主要是由于木质素与结构性碳水化合物形成复杂基质，阻碍了瘤胃厌氧条件下的微生物降解。
为提高木质纤维素副产品的饲料价值，已开发出多种预处理方法，包括机械、化学、热力和生物过程。然而，许多方法的实际应用常受高运营成本、大量能源需求、技术复杂性或不利环境影响所限制。作为一种有前景的替代方案，使用木质纤维素分解微生物进行生物预处理已成为提高纤维性农业残留物消化率的一种可持续策略。在这些微生物制剂中，能够分泌纤维素酶、木聚糖酶和木质素酶等纤维素分解和木质素分解酶的细菌尤其引人关注，它们能将植物细胞壁解构为更易获取和发酵的形式。
在自然界中，白蚁、甲虫和蟑螂等昆虫高效分解植物生物量的能力即是例证。这种能力主要归因于其胃肠道内存在的特化消化酶和共生微生物。豹蠹蛾（Zeuzera pyrina L., Lepidoptera: Cossidae）是一种全球分布的钻木昆虫，就是一个显著的例子。其幼虫专门以木质化植物组织为食2-3年，从较小的枝条逐渐发展到主干。这种消化木质化植物组织的卓越能力表明其肠道内存在木质纤维素降解微生物。迄今为止，豹蠹蛾消化道中的微生物群落及其在将纤维性作物残留物生物转化为反刍动物饲料方面的潜在应用仍未得到探索。
微生物接种剂的效果不仅取决于其酶潜力，还取决于其应用模式。虽然单一细菌菌株接种剂可能对特定底物分解有效，但它们通常缺乏完全降解复杂木质纤维素结构所需的协同相互作用。相比之下，包含功能多样性菌株的微生物联合体可以模拟自然生态系统（如人或昆虫肠道）的稳健和协同动力学。此类联合体通常在降解更广泛的木质纤维素化合物方面表现出更强的代谢多功能性、稳定性和效率。此外，在培养基中添加易利用的碳源和氮源（如葡萄糖和尿素）已被证明可以增强微生物增殖和酶活性。因此，这些添加剂的协同使用可能会放大微生物产量和纤维组分的酶促分解。
本研究聚焦于一个由葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、短杆菌属（Brevibacterium sp.）和肠杆菌属（Enterobacter sp.）组成的细菌联合体，这些菌株通过16S rRNA基因测序从豹蠹蛾肠道中分离得到。据我们所知，尚无先前研究探讨源自豹蠹蛾肠道的细菌联合体在农业副产品生物转化中的应用。因此，本研究旨在探讨这种木质纤维素降解细菌联合体，在有无微生物生长促进剂（葡萄糖和尿素）的情况下，对提高DPL反刍动物饲用营养价值的协同效应。效果评估基于化学成分变化、体外产气量（IVGP）、发酵特性以及微生物酶活性等关键指标。
2 材料与方法
2.1 样品采集与地点描述
椰枣叶（DPL）于2024年夏季从伊朗西南部胡齐斯坦省阿瓦士市附近的各种农业地点采集。该地区位于胡齐斯坦平原，属于底格里斯-幼发拉底河和卡伦河冲积低地，西接美索不达米亚盆地。该地区土壤为钙质冲积土（Aridisis order），质地为粉砂粘壤土至粘壤土。这些土壤通常呈碱性（pH > 7.5），中度至高度盐渍化，椰枣树对此条件适应良好。气候为干旱气候，在柯本-盖格系统下分类为BWh（热带沙漠气候）。夏季漫长且极其炎热，7月和8月的平均最高温度常超过45°C。冬季温和（8°C–18°C），该地区降水稀少且不稳定，年平均降雨量低于200毫米，主要发生在11月至次年4月。相对湿度经常很高，夏季尤其沿海平原地区超过70%。
2.2 叶片取样与处理
从四个不同的农业点获取DPL样品。在每个地点，从五棵健康的椰枣树（树龄约10-14年）上采集成熟、完好的叶片，共获得20个样品。使用灭菌设备将叶片切割，放入干净的塑料袋中，并立即运送到实验室。在实验室中，叶片首先使用配备1毫米筛网的Wiley粉碎机彻底干燥和粉碎。为去除可能作为生长促进剂评估中混杂变量的可溶性化合物，将粉碎后的材料进行热水提取过程，1小时内换水三次。所得不溶性纤维残留物在60°C下干燥48小时，随后作为实验生长底物加入培养基中。
2.3 细菌分离、筛选与鉴定
本研究中使用的细菌菌株先前从豹蠹蛾（Zeuzera pyrina L.）后肠中分离。简言之，从伊朗西部恰哈马哈勒-巴赫蒂亚里省萨曼县受感染的核桃枝上采集三龄幼虫（1龄以下），其体表通过浸入95%乙醇然后在无菌TB培养基中清洗进行灭菌。解剖后肠，将其内容物在补充有300 mg/L脱碱木质素的TB培养基中匀浆，制成肠道接种物。为进行分离，将1 mL肠道接种物转移到含有补充有0.5 g/L各种木质纤维素底物（包括小麦秸秆（WS）、WS的HCl-木质素、锯末、锯末的HCl-木质素、甘蔗梢（ST）、ST的HCl-木质素和硫酸盐木质素）的无菌基础培养基（SBM）的锥形瓶中。SBM每升含：7.0 g K2HPO4, 3.0 g KH2PO4, 1.0 g (NH4)2SO4, 0.1 g MgSO4·7H2O。在30°C摇床培养48小时后，将培养物涂布到相应的琼脂平板上。通过连续传代培养纯化 distinct 细菌菌落，获得8个独特分离株。这些分离株经过两阶段筛选过程。首先，评估它们在七种含有木质素和木质纤维素的不同培养基上的增殖能力。通过五个通过初筛的分离株，然后通过测量木质素过氧化物酶（LiP）活性来筛选其降解木质素的功能能力。该测定涉及在含有硫酸盐木质素的M9培养基中培养分离株，并量化酶氧化Azure B染料的能力。选择表现出最高LiP活性的三个分离株进行分子鉴定。从每个分离株中提取基因组DNA，使用通用引物通过聚合酶链式反应（PCR）扩增16S rRNA基因。PCR反应混合物（总体积25 μL）包含1.0 μL模板DNA, 1.5 μL Taq DNA聚合酶, 2.5 μL 10X缓冲液, 每种dNTP各200 μM, 正向和反向引物各1 μL（浓度各10 ρmol）, 2 mM MgCl2, 和去离子水。扩增条件如下：94°C初始变性5分钟；30个循环：94°C变性1分钟，58°C退火40秒，72°C延伸150秒；最后72°C延伸20分钟。所得PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳验证。随后，对PCR扩增子进行测序，并通过BLAST算法与GenBank数据库中的序列进行比较。系统发育分析将这三个菌株鉴定为葡萄球菌属（Staphylococcus）、短杆菌属（Brevibacterium）和肠杆菌属（Enterobacter）。这些鉴定出的菌株随后被培养以制备用于DPL处理实验的细菌接种物混合物。
2.4 实验处理与接种物制备
使用根据Kato等人配制的液体培养M9培养基作为所有培养的基础。培养基每升含：6.2 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4）, 3.0 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）, 0.5 g 氯化钠（NaCl）, 和 1.0 g 氯化铵（NH4Cl）。营养补充剂（葡萄糖和尿素）按处理规定添加。细菌接种物由三种木质纤维素降解细菌菌株（葡萄球菌属、短杆菌属和肠杆菌属）组合而成，这些菌株最初从豹蠹蛾肠道微生物群中分离。每种菌株在营养肉汤中单独培养48小时，细胞密度通过平板计数法测定，最终浓度各为107CFU/mL。营养肉汤每升蒸馏水含：5.0 g牛肉浸膏, 5.0 g动物组织胃蛋白酶消化物, 1.50 g氯化钠, 和1.50 g酵母浸膏。混合接种物通过等体积（各1 mL）混合这三种细菌悬浮液制备。建立六种实验处理：未处理的DPL（对照）、DPL加M9液体培养基（T1）、DPL加3 mL混合细菌接种物处理（T2）、T2加0.5%葡萄糖（T3）、T2加0.5%尿素（T4）、以及T2加0.5%葡萄糖和0.5%尿素（T5）。
2.5 LiP活性测定
使用改良版的Archibald所述程序测定所有六种处理的LiP活性。每种处理制备五个重复锥形瓶（100 mL Erlenmeyer型）（共30个瓶）。每个瓶含10 mL M9培养基和100 mg水提DPL作为唯一碳源（最终浓度1% w/v）。每个瓶接种3 mL制备的混合细菌悬浮液。培养物在37°C、连续110 rpm振荡下培养8天。培养后，根据Arora和Gill的方法制备粗酶提取物。首先通过Whatman 1号滤纸过滤培养物内容物以去除颗粒物。然后将滤液在10,000 × g下离心20分钟，所得上清液（CS）作为粗酶提取物收集。通过测量Azure B的氧化脱色来评估LiP活性。反应混合物含1.0 mL 125 mM酒石酸钠缓冲液（pH 3.0）, 500 μL 0.16 mM Azure B染料, 500 μL粗酶提取物, 和500 μL 2 mM过氧化氢。通过添加过氧化氢启动反应，并在610 nm处监测吸光度的降低。一个单位的LiP活性定义为每毫升培养滤液每分钟吸光度降低0.1。所有处理所得的酶活性水平见表1。
2.6 DPL的生物处理
共使用30个1 L锥形瓶实施六种不同处理，每种处理重复五次。每个瓶含500 mL M9培养基，补充有2.5%（w/v）的水提DPL，即每瓶12.5 g。高压灭菌后，向瓶中接种3 mL细菌悬浮液。该接种物由等体积（各1 mL，浓度为107CFU/mL）的葡萄球菌属、短杆菌属和肠杆菌属组成，这些菌株已在营养肉汤中预培养48小时。将瓶涡旋2分钟，确保接种物在DPL底物上均匀分布。随后，所有瓶在37°C、有氧条件下，在摇床（110 rpm）中培养21天。培养期结束后，过滤培养物内容物以分离固体残留物。回收的固体进行烘箱干燥并称重。为进一步分析程序，将每种处理五个重复中的四个干燥残留物合并为一个样品。
2.7 瘤胃内容物取样与体外发酵程序
瘤胃液从两只成年、安装瘤胃瘘管的洛里公羊（平均体重：45.0 ± 1.14 kg）采集，这些羊饲养于洛雷斯坦大学农学院农业研究站。动物在受控条件下饲养，所有实验程序严格遵守动物福利标准进行，并根据《农业动物在研究与教学中的护理和使用指南》经机构指南审查和批准。公羊饲喂平衡的全混合日粮（TMR），根据NRC推荐量配制以满足其维持需要。TMR的干物质（DM）组成（g/kg DM）如下：WS（400）、苜蓿干草（100）、玉米青贮（100）、粉碎玉米粒（270）、麦麸（110）、尿素（9.0）、碳酸钙（5.5）、普通盐（2.5）和矿物质-维生素补充剂（2.5）。饲料每日07:00和17:00分两次等量投喂，自由饮水。经过14天适应期后，在早晨饲喂前，通过真空泵从瘤胃内多个部位采集瘤胃液。
采集的材料立即放入预加热至39°C的保温容器中，以保持微生物活性，并在厌氧条件下运输至实验室。在实验室中，将两只动物的内容物合并，彻底均质，并在连续CO2流下通过三层亚麻布过滤。从采集到开始IVGP测定的时间不超过30分钟，以保持微生物活力。
对于IVGP参数，三次独立运行共使用81个瓶。这包括六种处理，每次运行每个处理四个重复，加上每次运行三个空白（仅瘤胃液），导致每个处理总共12个重复（6处理 × 4重复 × 3次运行 + 9空白 = 81瓶）。对于发酵特性，三次运行共使用117个瓶。这包括六种处理，每次运行每个处理六个重复，加上每次运行三个空白，导致每个处理总共18个重复（6处理 × 6重复 × 3次运行 + 9空白 = 117）。
产气（GP）动力学在120小时培养期内监测，使用 adapted from Marten和Barnes的标准方案。对于测定，将250 mg（DM基础）处理过的DPL底物（粉碎至1 mm）称重放入125 mL血清瓶中。每个瓶接收5 mL过滤的瘤胃接种物和20 mL厌氧缓冲溶液。在密封用丁基橡胶塞和铝盖之前，用CO2冲洗瓶的顶空。轻轻混合后，将瓶在39°C的恒温水浴中培养。使用数字压力系统在3、6、9、12、16、24、48、72、96和120小时记录累积GP。气体压力（psi）用于基于线性表达式计算相应的体积（mL），其中V是体积（mL）；P是压力（psi）；X是最佳拟合线的斜率；I是y轴截距（偏差校正因子）。
培养24小时后，通过将瓶置于冰浴中来终止发酵。一旦冷却至约25°C（室温），记录最终气体压力。使用校准的pH计立即测量发酵内容物的pH。
收集上清液的子样本并保存用于后续分析。将5 mL样品与等体积的0.1 N HCl混合，并在-20°C下保存用于氨氮测定。另取5 mL样品用等体积的25%（w/v）偏磷酸稳定，并在-20°C下冷冻用于挥发性脂肪酸（VFA）分析。剩余的固体残留物进行制备；一部分用于瘤胃酶活性分析，另一部分在60°C的强制通风烘箱中干燥48小时以测定体外干物质消化率（IVDMD）。
2.8 计算
通过将数据拟合到?rskov和McDonald的指数模型来评估IVGP，其中Y是时间t（h）的累积气体体积（mL）；a是可溶性部分的气体体积（mL）；b是不可溶但可发酵部分的潜在气体产量（mL）；c是气体生产的分数速率（h-1）。
IVDMD在培养24小时后测定。将每个瓶的内容物通过预称重的Whatman 1号滤纸过滤，残留物在60°C的强制通风烘箱中干燥48小时。IVDMD计算为：（初始DM重量 - 残留DM重量）/ 初始DM重量 × 1000，其中初始DM重量是孵育的底物重量，残留DM重量是发酵后残留物的干重。
使用Menke等人的回归方程估算代谢能（ME）和体外有机物（OM）消化率（IVOMD）：ME (MJ/kg DM) = 2.20 + 0.1357 × GP + 0.0057 × CP + 0.0002859 × CF2，IVOMD (g/kg) = 148.4 + 8.89 × GP + 4.09 × CP + 0.1306 × CF，其中GP是24小时净产气量（mL/200 mg DM）；CP和灰分分别是原始底物的粗蛋白和灰分含量（g/kg DM）。
根据Getachew等人的方法计算短链脂肪酸（SCFA）产量：SCFA (mmol/g DM) = 0.0239 × GP - 0.0601，其中GP是24小时净气体体积（mL/g DM）。
使用Blümmel等人的化学计量法估算微生物蛋白合成（MPS）：MPS (mg) = （底物消化量 (mg) - 气体 (mL) × 2.2 mg/mL），其中ADS是表观消化底物的量（mg），气体是24小时净气体产量，2.2 mg/mL是每毫升气体用于SCFA生产的元素（碳、氢、氧）质量的化学计量因子。
2.9 瘤胃酶活性
评估与颗粒物部分相关的酶活性。收集离心后瓶内容物的固体沉淀，并根据 adapted from Nogueira Filho等人的方法进行处理。将沉淀重新悬浮在等体积的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 6.8）中。为增强细胞破碎，添加溶菌酶（4 g/L）和四氯化碳（每6 mL悬浮液1 mL）。将混合物在冰上超声处理（6个循环，每个循环30秒，振幅27,000 × g，间歇30秒），然后在4°C下以27,000 × g离心30分钟，小心收集所得上清液（CS）作为酶提取物。
根据Agarwal的方法测定羧甲基纤维素酶（CMCase）、微晶纤维素酶（MCCase）和滤纸降解（FPD）酶的活性。CMCase测定混合物含1 mL磷酸盐缓冲液（0.1 M, pH 6.8）, 0.5 mL CS, 和0.5 mL 1%羧甲基纤维素。MCCase测定含1 mL缓冲液, 1 mL CS, 和1 mL 1%微晶纤维素。FPD测定含1 mL缓冲液, 1 mL CS, 和一条0.5 g的Whatman 1号滤纸条。所有测定在39°C下进行60分钟。通过加入3 mL 1%二硝基水杨酸试剂终止反应。释放的还原糖使用Miller的方法比色法定量为葡萄糖当量。一个单位（U）的酶活性定义为在指定测定条件下，每小时每毫升酶释放1 μmol葡萄糖所需的酶量。
2.10 两阶段养分消化率
总共使用135个瓶进行处理过的DPL底物的体外两阶段消化测定。这包括六种处理，每种处理七个重复，以及每次运行三个空白对照（仅含瘤胃液），跨越三次独立的实验运行。消化程序遵循Tilley和Terry最初概述的体外两阶段方法。
2.11 实验室分析
根据AOAC International的标准方法测定底物的DM（方法930.15）、灰分（方法924.05）和氮（N, 方法954.01）含量。通过从底物的初始重量中减去培养21天后剩余残留物的重量来计算DM损失。使用顺序洗涤剂方法分析纤维组分。根据van Soest等人的方法测定无灰中性洗涤纤维（NDFom），不使用亚硫酸钠或α-淀粉酶。根据AOAC方法973.18（2012）分析无灰酸性洗涤纤维（ADFom）。随后通过用72%硫酸处理ADFom残留物测定酸性洗涤木质素（ADL），表示为木质素（sa）。根据Broderick和Kang的方法比色法测量发酵液中的氨氮浓度。使用气液色谱法测定VFA谱，以乙基丁酸作为内标，遵循Stewart和Duncan的程序。将解冻的瘤胃液样品转移到15 mL玻璃试管中，并在4°C下以10,000 g离心10分钟。将1 mL上清液等分试样注入Varian 3400气相色谱仪，该仪器配备170°C的进样器、175°C的火焰离子化检测器和填充柱（2 m × 2 mm i.d. 玻璃柱，填充1–1965 10% SP-1200/1% H3PO4on 80/100 Chromosorb W）。气相色谱仪烘箱温度是等温的，维持在140°C。气体流速为氮气40 mL/min，压缩空气300 mL/min。
2.12 统计分析
实验按完全随机设计安排。使用SAS（9.4版）的MIXED过程分析IVGP、发酵参数、养分消失、水解酶活性和VFA谱的数据，模型为：Yijk= μ + Ti+ Rj+ eijk，其中Yijk是观察到的因变量，μ是总体均值，Ti是第i个处理的固定效应，Rj是第j次实验运行的随机效应，eijk是残差误差。
使用GLM过程分析LiP活性和处理过的DPL化学成分的数据，模型为：Yij= μ + Ti+ eij，其中Yij是观察到的变量，μ是总体均值，Ti是处理的固定效应，eij是残差误差。
对于两种分析，使用Duncan多重范围检验比较处理均值，结果在p < 0.05时被认为具有统计学显著性。
3 结果
3.1 LiP活性
豹蠹蛾肠道细菌混合物（包含葡萄球菌属、短杆菌属和肠杆菌属）在不同处理条件下培养在DPL上的LiP活性见表1。在对照组（未处理DPL）或T1（仅添加液体培养基的DPL）中均未检测到LiP活性，两者记录活性均为0.00 U/mL/min。仅含细菌接种物的T2表现出显著更高的活性，为0.202 U/mL/min（p < 0.01）。添加葡萄糖或尿素增强了LiP活性；T3（含0.5%葡萄糖）和T4（含0.5%尿素）分别显示活性增加至0.269和0.266 U/mL/min，两者均显著高于T2，但彼此之间无显著差异。在T5中观察到最高的LiP活性，该处理结合了0.5%葡萄糖和0.5%尿素以及细菌接种物，达到0.328 U/mL/min。该值显著大于所有其他实验处理（p < 0.05），表明碳源和氮源的组合对酶生产具有协同效应。
3.2 处理过的DPL的化学成分变化
DPL的化学成分受豹蠹蛾肠道细菌混合物和生长促进剂添加的显著影响（表2）。与对照组和T1相比，所有接种处理的DM重量损失均显著增加（p < 0.01）。与其他处理相比，在T5中观察到最高的DM损失（61.1 g/kg DM），表明当同时补充葡萄糖和尿素时降解增强。CP含量在各处理组中也显著增加（p < 0.01），从对照组的52.2 g/kg上升到T5的70.3 g/kg，可能反映了微生物蛋白的富集。NDFom含量显著降低（p = 0.04），与对照组、T1和T2相比，T5的降低幅度最大（571 g/kg DM），表明结合营养补充改善了纤维降解。尽管ADFom含量显示出不显著的下降趋势（p = 0.09），但其最低值记录在T5中（409 g/kg DM）。与对照组和T1相比，所有接种处理的ADL含量均显著降低（p < 0.01），T5达到最低ADL（83.8 g/kg DM）。相比之下，各处理间的OM含量在统计上保持不变（p = 0.26），表明尽管存在组成变化，有机成分的整体比例基本保持不变。
3.3 体外产气、发酵谱和养分消化率
培养24小时后的体外产气量（GP24）在各处理间无统计学显著差异（p = 0.09；表3），尽管在T5中观察到最高值（27.7 mL），在对照组中最低（21.5 mL）。相比之下，120小时后的总IVGP受处理显著影响（p < 0.01）。对照组和T1的气体体积最低（分别为48.2和49.1 mL），而所有其他接种组（T2–T5）表现出显著更高的值，T5达到最大值61.2 mL。类似地，来自可发酵部分（b）的GP随着细菌接种而显著增加（p < 0.01），范围从对照组的49.7 mL到T5的63.5 mL。然而，GP的速率常数（c）在各处理间保持统计不变（p = 0.23）。对照组和T1的IVDMD值最低（分别为385和388 g/kg DM），而T5显示出最高的消失率，为453 g/kg（比对照组增加17.66%），表明微生物降解增强。在IVOMD中观察到类似趋势，从对照组的392 g/kg增加到T5的452 g/kg（比对照组增加15.31%）。估计的ME也随处理显著改善（p = 0.04），从对照组的4.83 MJ/kg DM增加到T5的5.61 MJ/kg。SCFA浓度趋于随处理增加，尽管差异不显著（p = 0.09）。MPS随处理显著升高（p < 0.05），从对照组的347 mg/g DM增加到T5的405 mg/g。虽然pH值在各处理间略有下降，范围从对照组的6.37到T5的6.16，但变化不显著（p = 0.13）。然而，氨氮浓度随处理显著增加（p = 0.03），从对照组的8.85 mg/dL上升到T5的10.2
