Wnt3a与Loxl2双靶点协同诱导肝癌干细胞铁死亡并抑制肿瘤发生的作用机制研究

《Cancer Science》：Targeting Wnt3a and Loxl2 Synergistically Induces Ferroptosis in Liver Cancer Stem Cells and Suppresses Tumorigenesis

本研究发现Wnt3a和Loxl2双基因敲除可通过上调ZEB1表达，协同增强肝癌干细胞（LCSCs）的铁死亡（ferroptosis）水平，显著抑制原位肝癌生长。研究通过生物信息学分析结合体内外实验证实，双基因敲除组肿瘤抑制率达93%，且铁死亡标志物Fe2+、MDA显著升高，GSH降低。该研究为肝癌靶向治疗提供了新策略。

　　

引言

肝细胞癌（HCC）作为原发性肝癌的主要类型，其发病率和死亡率持续上升，是全球重大健康挑战。肝癌干细胞（LCSCs）具有自我更新和分化能力，在肝癌发生、免疫逃逸、转移和复发中起关键作用。铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的程序性细胞死亡形式，通过脂质过氧化物积累导致细胞死亡，在肿瘤治疗中具有潜力。Wnt信号通路和赖氨酰氧化酶（Lox）家族成员与铁死亡相关。本研究探讨Wnt3a和/或Loxl2敲低对LCSCs和小鼠原位肿瘤生长的影响，并分析铁死亡相关基因的作用。

材料与方法

通过GEO数据库和FerrDb数据库筛选HCC与铁死亡相关的差异表达基因（DEGs），使用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过DAVID进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。从Hep3B细胞中分选CD133⁺/EpCAM⁺LCSCs，利用慢病毒转导构建Wnt3a和/或Loxl2敲低细胞模型。采用CRISPR-Cas9技术构建Wnt3a和Loxl2基因敲除小鼠，并建立原位肝癌模型。通过铁测定试剂盒检测Fe²⁺含量，ELISA法检测GSH和MDA水平，qPCR和Western blot分析基因表达。

结果

生物信息学分析

筛选出199个HCC铁死亡相关DEGs，PPI网络分析确定ZEB1为关键基因。GO和KEGG分析显示这些基因主要富集在缺氧反应、氧化应激、MAPK级联和mTOR信号通路等过程。

LCSCs分选与鉴定

流式细胞术分选CD133⁺/EpCAM⁺LCSCs，纯度达94%。

基因敲低促进铁死亡

Wnt3a和/或Loxl2敲低后，LCSCs中Fe²⁺和MDA水平升高，GSH降低，双敲低组变化最显著。

体内实验验证

基因敲除小鼠原位肿瘤模型显示，单敲除和双敲除组均抑制肿瘤生长，抑制率分别为51%、71%和93%。肿瘤组织中Fe²⁺和MDA升高，GSH降低，双敲除组效应最强。

ZEB1表达上调

细胞和动物实验中，Wnt3a和/或Loxl2敲低均上调ZEB1表达，双敲除组上调最明显。

讨论

本研究首次揭示Wnt3a和Loxl2双敲除通过上调ZEB1协同诱导LCSCs铁死亡，显著抑制肝癌生长。ZEB1可能作为Wnt3a/Loxl2信号轴的上游调控因子，参与铁死亡调节。该研究为肝癌治疗提供了新靶点，但ZEB1与Wnt3a/Loxl2的具体调控机制需进一步探索。