甲型流感病毒诱导的ERK依赖性星形胶质细胞PAI-1表达，扰乱了PAI-1/tPA轴的神经化学平衡

《Neurochemistry International》：ERK-Dependent Astrocytic PAI-1 Induction by Influenza A Virus Disrupts the Neurochemical Balance of the PAI-1/tPA Axis

PAI-1/tPA系统失衡与ERK通路介导的神经元形态发育异常是流感病毒诱导神经炎症的关键机制。本研究通过体外星形胶质细胞培养，发现IAV感染通过激活ERK通路显著上调PAI-1表达并抑制tPA活性，且该过程与PB1-F2蛋白无关。感染后的星形胶质细胞 conditioned medium 可抑制神经元突起延伸和分支，揭示病毒通过调控胶质细胞纤溶系统影响神经元发育的新机制。

　　

朴恩淑（Eun-Sook Park）| 朴宝培（Bo-Bae Park）| 金荣恩（Ryeong-Eun Kim）| 洪允秀（Yoonseo Hong）| 权京佳（Kyoung Ja Kwon）| 申昌英（Chan Young Shin）

韩国建国大学医学院医学系

摘要

背景

甲型流感病毒（IAV）虽然主要是一种呼吸道病原体，但越来越多地被认为会影响中枢神经系统（CNS）的功能。星形胶质细胞是神经化学稳态和神经炎症的关键调节者，然而它们对IAV反应的分子机制尚未完全阐明。

方法

原代大鼠星形胶质细胞被野生型IAV（PR8, H1N1）或PB1-F2缺失型IAV（PB1-F2[?]）感染。通过qPCR、Western blotting、zymography和ELISA检测纤溶酶原激活剂抑制剂-1（PAI-1）/组织型纤溶酶原激活剂（tPA）系统的调节情况。使用磷酸特异性抗体评估ERK通路的激活情况，并通过ERK抑制剂U0126测试通路的依赖性。利用星形胶质细胞条件培养基（ACM）通过神经突起生长实验评估其对神经元的功能影响。

结果

IAV感染显著增加了星形胶质细胞中的PAI-1表达并降低了tPA活性，同时选择性激活了ERK信号通路。药物抑制ERK可完全消除PAI-1的上调，表明ERK对于这种神经化学变化是必需的。PB1-F2的缺失并未改变PAI-1的表达，但部分改变了细胞因子的表达谱，表明PAI-1/tPA轴的调节不依赖于PB1-F2。与脂多糖（LPS）相比，IAV引起的细胞因子水平显著较低，但PAI-1表达显著升高，表明其具有持续的抗纤溶特性。暴露于IAV感染星形胶质细胞产生的ACM中的神经元表现出神经突起生长和分支减少，表明其结构发育受到干扰。

结论

IAV触发星形胶质细胞中PAI-1的ERK依赖性上调，导致tPA活性抑制和神经元生长受阻。这些发现揭示了星形胶质细胞特异性MAPK信号通路与病毒感染期间的神经炎症和抗纤溶功能障碍之间的联系。

引言

甲型流感病毒（IAV）传统上被认为是一种感染呼吸道上皮细胞并引发全身性炎症的病原体。然而，越来越多的证据表明，即使在没有广泛病毒侵袭的情况下，流感病毒感染也与中枢神经系统（CNS）功能障碍有关。无论是神经嗜性还是非神经嗜性的流感病毒株，都在动物模型中引起了持续的神经炎症反应和行为或认知改变（Hosseini等人，2018年）。尽管甲型流感病毒（IAV）直接感染中枢神经系统的情况相对较少，但越来越多的研究表明，在特定的实验和病理条件下，胶质细胞——尤其是星形胶质细胞——在病毒相关的神经炎症和神经病理反应中起着关键作用（Hosseini等人，2018年；Ng等人，2018年）。

星形胶质细胞是丰富的多功能胶质细胞，对中枢神经系统的稳态、代谢、血脑屏障（BBB）的完整性以及神经递质的再循环至关重要（Verkhratsky等人，2023年）。它们也是大脑中的关键免疫效应器（Potokar等人，2023年）。尽管在体内星形胶质细胞中的有效感染似乎很少见，且这些观察结果可能反映了受控的实验条件而非生理性的病毒侵袭，但使用离体原代小鼠星形胶质细胞培养的实验研究表明，当以实验性的高感染复数（MOI）应用时，流感病毒可以进入星形胶质细胞并引发凋亡和炎症反应（Wang等人，2008年）。对感染人类星形胶质细胞的转录组分析进一步显示了炎症和代谢基因表达的广泛变化，强调了星形胶质细胞在宿主抗病毒反应中的积极作用（Lin等人，2015年）。因此，本研究将星形胶质细胞感染作为体外模型，用于研究病毒诱导的星形胶质细胞信号通路机制，而不是体内生理性中枢神经系统感染的代表。

临床上，IAV感染与多种神经系统和神经精神并发症有关，包括抑郁、焦虑、癫痫发作和脑病（Davis等人，2014年；Mizuguchi，2013年；Paksu等人，2018年）。流感相关性脑病（IAE）是一种急性且可能致命的疾病，在东亚的儿童人群中尤为普遍（Steininger等人，2003年；Surtees和DeSousa，2006年）。尽管这类并发症较为常见，但将流感感染与中枢神经系统功能障碍联系起来的精确分子机制仍不清楚。

除了宿主定向的炎症反应外，甲型流感病毒还编码来自PB1基因片段另一个开放阅读框的辅助蛋白PB1-F2，该蛋白已被广泛认为是能够调节线粒体功能、先天免疫信号和炎症病理的毒力因子（Chen等人，2001年；Conenello和Palese，2007年；McAuley等人，2007年）。PB1-F2通过线粒体和细胞质机制干扰宿主的抗病毒防御和细胞稳态，从而以细胞类型和情境依赖的方式放大病毒引起的组织功能障碍（Park等人，2019年；Varga等人，2011年）。然而，尽管有越来越多的证据表明PB1-F2在上皮细胞和免疫细胞中发挥作用，但其在中枢神经系统星形胶质细胞信号通路中的贡献尚未得到探索。鉴于星形胶质细胞在调节PAI-1/tPA轴和塑造神经炎症微环境中的核心作用，我们研究了PB1-F2是否参与了流感诱导的星形胶质细胞PAI-1/tPA平衡失调及其对神经元形态的下游影响。

最近的研究表明，包括COVID-19在内的病毒感染可以破坏纤溶酶原激活系统（PAS），导致纤溶作用受损、血栓形成和组织重塑异常（Whyte等人，2020年；Yang和Tang，2016年）。在这个系统中，纤溶酶原激活剂抑制剂-1（PAI-1）通过抑制组织型纤溶酶原激活剂（tPA）和尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）的纤溶活性而起关键调节作用（Yang和Tang，2016年）。除了止血作用外，PAI-1还影响神经炎症、突触可塑性和神经元存活（Lebas等人，2022年；Yanev等人，2025年）。然而，其在流感诱导的神经炎症或神经精神结果中的具体作用仍大部分未被探索。

PAS由tPA、uPA和PAI-1组成，是中枢神经系统炎症中一个关键但未被充分认识的调节轴。tPA催化纤溶酶原转化为纤溶酶，促进细胞外基质（ECM）的重塑、细胞迁移和信号传导（Gur-Wahnon等人，2013年），而PAI-1通过抑制tPA和uPA来抵消这些作用，维持蛋白水解的稳态（Declerck和Gils，2013年）。在大脑中，星形胶质细胞通过表达tPA和PAI-1在PAS调节中起积极作用，从而影响局部的纤溶活性和神经元可塑性（Goeke等人，2022年）。在炎症条件下，星形胶质细胞中的PAI-1表达显著上调，使蛋白水解平衡偏向于ECM稳定，并可能放大神经炎症信号（Lebas等人，2022年）。此外，星形胶质细胞产生的tPA和PAI-1具有不同的生理意义：星形胶质细胞的tPA独立于神经元的tPA调节缺血性损伤（Kim等人，2011年），而降低的PAI-1可以增强干细胞治疗后的tPA介导的神经突起生长和恢复（Xin等人，2010年）。

尽管有这些发现，病毒感染——特别是IAV——对星形胶质细胞PAS调节的影响仍几乎未被探索。鉴于流感感染会触发星形胶质细胞的激活和神经炎症信号传导，且PAS与ECM重塑、血脑屏障功能和细胞间通讯密切相关，因此IAV可能调节星形胶质细胞的tPA/PAI-1平衡，从而影响中枢神经系统的炎症和修复。

在这项研究中，我们使用原代大鼠星形胶质细胞培养来研究IAV感染后PAI-1表达的诱导，并阐明这一反应背后的信号机制。此外，我们还研究了病毒对星形胶质细胞PAI-1/tPA轴的调节如何影响神经元形态，旨在揭示流感诱导的胶质细胞失调与中枢神经系统功能障碍之间的机制联系。

部分内容

原代大鼠星形胶质细胞和神经元培养

根据既定方案（Bang等人，2021年；McCarthy和de Vellis，1980年；Schildge等人，2013年）从出生后第2天的Sprague–Dawley大鼠大脑皮层中分离原代星形胶质细胞，并进行了少量修改。新生大鼠来自Samtako公司（韩国京畿道）。动物处理符合机构指南，所有实验程序均得到了建国大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准

甲型流感病毒增加原代大鼠星形胶质细胞中的PAI-1表达

由于星形胶质细胞在中枢神经系统（CNS）的神经炎症信号传导中起关键作用，我们研究了IAV感染是否会影响这些细胞中的PAI-1表达。为此，按照示意图（图1A）培养原代大鼠星形胶质细胞，并将其用作体外模型来评估星形胶质细胞对IAV感染的反应。为了验证我们的实验条件下的病毒基因表达，使用感染星形胶质细胞的裂解物进行了RT-PCR，并检测了病毒NP和M转录本

讨论

IAV不仅影响其主要呼吸道靶标，还影响多个生理系统，越来越多的证据表明它也会影响中枢神经系统（CNS）。流感相关性脑病（IAE）是最严重的神经系统并发症之一，尤其是在儿童人群中，其特征是脑水肿、代谢衰竭和血脑屏障（BBB）破坏（Kimura-Ohba等人，2024年）。已观察到病毒的进入和复制

结论

本研究表明，星形胶质细胞中的PAI-1可能参与了甲型流感病毒诱导的神经生物学稳态和星形胶质细胞-神经元在中枢神经系统中的通讯改变。IAV在原代星形胶质细胞中强烈激活了ERK信号通路，导致PAI-1显著上调和tPA活性抑制，从而使蛋白水解平衡向抗纤溶状态转变。这种依赖于ERK的机制独立于病毒的PB1-F2蛋白，并伴随着选择性的

手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

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CRediT作者贡献声明

金荣恩（Ryeong-Eun Kim）：写作——审阅与编辑、研究、数据分析。朴宝培（Bo-Bae Park）：研究、数据分析。朴恩淑（Eun-Sook Park）：写作——审阅与编辑、初稿撰写、项目管理、方法学、资金获取、概念化。申昌英（Chan Young Shin）：写作——审阅与编辑、监督、项目管理、方法学、概念化。权京佳（Kyoung Ja Kwon）：初稿撰写。洪允秀（Yoonseo Hong）：数据管理

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数据可用性

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资助

本工作得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助（编号：RS-2022-NR070076）。

利益冲突声明

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致谢

不适用