斑马鱼运动成熟过程中反向持续电流的发育动态差异塑造运动神经元放电模式

《The Journal of Physiology》：Distinct developmental dynamics of opposing persistent currents shape motoneuron firing during motor maturation of zebrafish

本文揭示了斑马鱼发育早期（2-5天）初级运动神经元中两种关键持续性离子电流——M电流（IM）和持续性钠电流（INaP）的非单调发育动态。研究发现IM在3天时达峰后下降，而INaP从2至5天逐渐减弱，这种差异性的调控共同决定了初级运动神经元在光诱发游泳反应中的募集模式，为脊髓运动控制通路的成熟机制提供了新见解。

　　

引言

在脊椎动物早期发育过程中，运动行为经历一系列逐步复杂化的转变。斑马鱼幼鱼因其快速发育和运动行为在出生后几天内 stereotyped 出现而成为研究运动控制成熟的理想模型。从2到5天 post-fertilization (dpf)，斑马鱼的游泳行为从依赖早生的初级运动神经元（pMNs）的快速、弹道式运动，转变为更多依赖晚生的次级运动神经元的较慢、更协调的运动。本研究旨在探究pMNs内在特性，特别是两种持续性离子电流在运动成熟过程中的作用。

初级运动神经元中表达对Kv7.2/7.3通道抑制剂XE-991敏感的电流

研究首次在3-5 dpf斑马鱼幼鱼的pMNs中揭示了M电流（I_M）的存在。通过标准的I_M失活方案，在pMNs中记录到I_M的电生理特征。该电流对Kv7.2/7.3通道的选择性药理抑制剂XE-991（10 μM）敏感，其振幅在-40至-20 mV电压范围内显著降低。然而，XE-991并未改变I_M的激活电压或达到半最大振幅的电压（V_1/2），表明其特异性影响了电流幅度而非电压依赖性。

Kv7.2/7.3通道的药理学调控改变斑马鱼幼鱼pMNs的内在特性

研究进一步探讨了I_M如何影响pMNs的内在特性。全细胞电流钳记录显示，使用ICA-069673（10 μM）激活Kv7.2/7.3通道可显著超极化pMNs的平均静息膜电位。在4-5 dpf的pMNs中，XE-991使阈值超极化，并增加了在195 pA电流步阶期间产生的最大峰电位数量，而ICA-069673仅增加了输入电阻。这些结果表明I_M参与调节pMNs的兴奋性。

pMNs中I_M幅度的发育变化

研究表征了2-5 dpf发育过程中pMNs的I_M特性。I_M的平均振幅从2 dpf到3 dpf显著增加，并在3 dpf达到峰值，随后在4 dpf和5 dpf下降。峰值I_M振幅从2 dpf到3 dpf显著增加，到4 dpf时减少近一半，但3 dpf到4 dpf的减少未达到统计学显著性。在电压依赖性方面，I_M的激活电压在3 dpf时比2 dpf和4 dpf时显著超极化。这些数据表明I_M的振幅和电压依赖性特性在2-5 dpf发育窗口期间发生变化，其幅度在3 dpf达到峰值。

斑马鱼发育早期pMNs中持续性钠电流的特征

研究还考察了与I_M协同作用的持续性钠电流（I_NaP）的发育变化。通过引入20 mV s^-1的去极化电压斜坡，在初始保持在-90 mV的pMNs中揭示了持久内向电流（PICs）。在2-4 dpf的pMNs中，利鲁唑（riluzole，一种已知的I_NaP抑制剂）显著降低了PICs的振幅。然而，在5 dpf时，利鲁唑不影响pMNs中PICs的振幅。这些数据显示I_NaP对PICs的贡献在不同年龄组内是不同的。比较各年龄组的对照发现，2-5 dpf pMNs中测得的PICs振幅无显著差异。利鲁唑（5 μM）从2 dpf到5 dpf逐渐降低峰值PIC振幅的效果变差。总体而言，这些数据揭示了在发育从2 dpf进展到5 dpf的过程中，I_NaP对pMNs中测得的PICs贡献的发育变化。

I_M药理学抑制对pMNs峰频率适应的影响在早期发育过程中发生变化

鉴于pMNs中I_M的幅度和I_NaP对PICs贡献的发育差异，研究调查了I_M和I_NaP在pMN功能中的作用。峰频率适应是持续去极化期间动作电位生成速率逐渐降低的现象，在运动神经元中常见。研究发现，在2 dpf时，XE-991或利鲁唑对各种处理的反应中，产生的峰数量没有显著影响。然而，当两种药理抑制剂共同浴槽应用时，观察到与对照相比显著减少。在3 dpf时，XE-991增加了产生的峰数量，而利鲁唑或XE-991和利鲁唑联合使用与对照无差异。在4 dpf时，在利鲁唑存在下以及XE-991和利鲁唑联合使用时，峰数量与对照相比显著减少，而XE-991单独使用无影响。到5 dpf时，pMNs在XE-991或利鲁唑单独存在下产生的峰数量与对照无差异；然而，在XE-991和利鲁唑联合给药时，对照与联合给药之间观察到显著减少。这些结果表明，抑制I_M仅在3 dpf时减少pMNs的峰频率适应。

I_M在光诱发游泳反应期间对pMN和神经活动的影响

研究通过同时在3 dpf和5 dpf记录pMN和运动神经的活动，探究I_M表达峰值在3 dpf时如何影响运动输出。在3 dpf时，XE-991增加了峰振幅，但在5 dpf时没有。时间平均AUC测量的总体运动神经输出在3 dpf和5 dpf的对照之间没有差异，但在3 dpf和5 dpf存在XE-991时增加。在3 dpf时，pMN的峰频率与神经反应达到的峰振幅显著相关。与5 dpf的pMNs相比，3 dpf pMNs在光诱发游泳反应期间的峰频率显著更高。在5 dpf时，pMN参与度显著低于3 dpf。在3 dpf时，XE-991降低了pMN峰潜伏期。这些结果表明，在3 dpf和5 dpf时，I_M限制了光诱发游泳反应期间的运动输出，这种效应在3 dpf最为显著，影响pMN峰频率和潜伏期。

I_M和I_NaP发育动态的影响

研究表明，3 dpf代表了斑马鱼运动控制发育的一个转折点。随着运动运动库远离pMN中心运动转变，pMNs在3 dpf后 paradoxically 在长电流步阶期间发放增加数量的动作电位。然而，pMNs的突触驱动可能在后期阶段没有增加。因此，研究提出I_NaP的发育性减少有助于减少pMNs在游泳过程中的参与，因为运动控制在斑马鱼中成熟，而I_M的短暂峰值确保了pMN在3 dpf时的适量参与。随着pMN募集减少，I_M也减少。I_M的这种减少反映了I_NaP的减少，使得I_M尽管幅度较小，足以抵消较小幅度的I_NaP，并在发育后期对较慢和较低幅度的运动活动（如光诱发反应）施加对pMN募集的控制。

I_M和I_NaP表达发育变化的可能机制

I_M和I_NaP的发育变化可能是Kv7.2/7.3通道和各种钠通道表达水平变化的结果。潜在的机制可能涉及通道表达、电压依赖性和门控动力学的变化。已知细胞内通路如磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP₂）是Kv7.2/7.3通道活性的重要调节因子。因此，从2 dpf到3 dpf PIP₂水平的增加可能 underlie Kv7.2/7.3活性的增加。PIP₂水平可由神经调节剂如5-羟色胺塑造，这是包括脊髓中间神经元和运动神经元在内的几种神经元类型中持久内向电流的已知调节剂。观察到的I_M变化可能反映了通道表达或功能的长期发育变化。

结论

研究首次在斑马鱼pMNs中揭示了I_M的表达。I_M对pMNs峰频率适应的调节与小鼠中观察到的I_M对运动神经元兴奋性的控制相似。此外，研究详细描述了I_NaP与I_M联合对运动神经元重复放电的调节作用，进一步支持了跨脊椎动物对峰频率控制的共享特征。出乎意料的是，在发育中的斑马鱼从严重依赖pMNs和快肌纤维的运动转变的年龄期间，发现了pMNs中I_M和I_NaP的不同发育动态。适当的pMN活动量至少部分由I_M和I_NaP的互补贡献决定。早期阶段的I_M水平可能是抵消相对较大的I_NaP以控制放电所必需的。随后，I_NaP和I_M在5 dpf的减少足以限制pMN在后期发育阶段较慢运动中的参与。I_M和I_NaP的发育变化表明神经特性的非常仔细和快速的调整，以在神经系统和肌肉骨骼系统内许多发育过程并行发生的年龄实现适当的运动成熟。