《Poultry Science》：Highly Efficient Gene Editing via Targeted Cas9 Insertion into Chicken Housekeeping Gene
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本研究针对禽类转基因表达不稳定、易表观沉默的难题，创新性地将CRISPR/Cas9系统靶向插入鸡持家基因ACTB和GAPDH位点，成功建立了能够稳定、高效表达Cas9蛋白的DF-1细胞系。通过单克隆筛选获得编辑活性达90%的细胞株，为家禽基因组工程提供了可靠平台。
在家禽生物技术领域，实现稳定高效的转基因表达一直是个棘手难题。传统方法如病毒载体和piggyBac转座子介导的转基因技术，虽然被广泛应用，却难以逃脱表观遗传沉默的魔咒——转基因表达往往出现组织特异性、随时间递减甚至完全沉默的现象。这种不稳定性严重制约了需要跨组织长期稳定表达的转基因应用。在哺乳动物中，科学家们通过将转基因靶向整合到基因组合适港口位点（如Rosa26），成功实现了稳定可预测的转基因表达。然而，类似的策略在禽类系统中尚未建立。
密苏里大学动物科学系的研究团队独辟蹊径，将目光投向了细胞内始终活跃的"管家"——持家基因。他们假设，将CRISPR/Cas9系统靶向插入鸡的持家基因ACTB和GAPDH中，可能实现稳定且泛表达的转基因表达，从而解决禽类转基因表达不稳定的痛点。这项发表在《Poultry Science》上的研究，为家禽基因组工程带来了突破性进展。
研究人员主要采用了两种关键技术方案：一是通过CRISPR/Cas9介导的非同源末端连接（NHEJ）机制，将包含Cas9和绿色荧光蛋白（GFP）的表达框靶向插入到持家基因的3'区域；二是设计基因标记策略，将Cas9-2A-GFP框插入到持家基因的最后一个内含子中，使其表达受内源基因调控元件的控制。实验在鸡DF-1成纤维细胞系中进行，通过荧光显微镜观察、连接处PCR、Sanger测序等技术验证靶向整合效率，并利用T7E1 assay和流式细胞术评估Cas9的编辑活性和表达稳定性。
靶向鸡ACTB和GAPDH基因
研究团队首先设计了特异性引导RNA（gRNA）靶向ACTB和GAPDH基因的3'区域和最后一个内含子。T7E1 assay和测序分析显示，针对ACTB基因的gRNA编辑效率分别为14.3%（3'区域靶向）和100%（内含子靶向），而针对GAPDH的gRNA编辑效率分别为50%（3'区域靶向）和28.6%（内含子靶向）。这些结果表明设计的gRNA具有高效的基因组编辑能力。
Cas9和GFP表达的靶向策略
研究人员构建了两种类型的靶向敲入载体：针对3'区域靶向的策略使用CAG启动子驱动Cas9和GFP表达；而基因标记策略则巧妙地去除了外源启动子，让Cas9-GFP的表达完全依赖于内源持家基因的调控机制。这种设计使得研究人员能够比较外源启动子驱动与内源基因背景介导的转基因表达效果。
在DF-1细胞中靶向敲入Cas9和GFP
通过共转染CRISPR/Cas9质粒和供体质粒，研究人员成功在DF-1细胞中实现了靶向整合。荧光显微镜观察显示，靶向编辑的细胞呈现明显的绿色荧光，而野生型细胞则无荧光信号。连接处PCR和测序分析进一步证实了Cas9-GFP框精确整合到了预期的基因组区域，且整合位点存在NHEJ修复特有的小片段插入或缺失（indel）。
基因组编辑DF-1细胞系中Cas9活性验证
为评估整合Cas9的功能活性，研究人员用靶向DMRT1/DMRT3基因间区的gRNA质粒转染四种敲入细胞系。结果显示，GAPDH靶向的细胞系（无论是3'区域敲入还是基因标记）均表现出显著的Cas9活性，而ACTB靶向的细胞系在相同条件下未检测到编辑活性。测序分析进一步证实，GAPDH靶向细胞系的编辑效率高达80-100%。
单克隆扩增和验证
研究人员从GAPDH基因标记的DF-1细胞系中分离出12个单克隆细胞系。通过连接处PCR和测序验证，所有克隆均成功实现了靶向整合，且均为杂合子（一个等位基因被精确修饰，另一个等位基因通过NHEJ修复产生indel）。定量PCR显示各克隆的Cas9拷贝数相当，但GFP表达水平存在明显差异。
选定Cas9标记克隆的综合验证
对随机选择的三个单克隆（#3、#13、#16）进行长期培养发现，GFP荧光在传代至第12代时仍保持稳定。Western blot分析证实了Cas9蛋白的表达，且表达水平与GFP荧光强度相关。重要的是，内源GAPDH蛋白表达在所有克隆中均接近正常水平，表明靶向整合未显著破坏内源基因功能。功能实验显示，这些单克隆细胞系的基因组编辑效率（77.8%-90%）显著高于野生型DF-1细胞瞬时表达Cas9的效率（33.3%）。
研究结论与讨论部分指出，该研究成功建立了CRISPR/Cas9介导的靶向敲入策略，将功能性Cas9基因稳定整合到鸡GAPDH基因座，实现了高效、可持续的基因组编辑。相比之下，ACTB基因座虽然能够支持报告基因表达，但可能由于表达水平不足或其他未知机制，未能产生可检测的基因组编辑活性。
单克隆细胞系之间观察到的表达和编辑效率差异，提示即使在同一整合位点，局部染色质环境或表观遗传调控也可能显著影响转基因的表达和功能。这一发现强调了在建立基因组编辑工具细胞系时进行充分分子和功能验证的重要性。
该研究构建的GAPDH靶向Cas9敲入DF-1细胞系为禽类系统提供了稳定、可重复使用的基因组编辑平台，避免了重复导入Cas9的需要，简化了gRNA筛选、高通量诱变和功能基因组学研究的工作流程。此外，该策略还可扩展至碱基编辑器或引物编辑器等其他基因组工程工具，以及组织特异性或诱导型表达框的整合。
尽管该研究主要在永生化成纤维细胞系中进行，但研究人员在鸡原始生殖细胞（PGC）中也验证了相同靶向策略支持稳定转基因表达的能力，表明该方法可能适用于多种鸡细胞类型，并具有跨代基因组修饰的应用潜力。最近的研究还确定了鸡ROSA样（cROSA）基因座（位于THUMPD3基因上游）作为禽类系统中的基因组安全港，与哺乳动物ROSA26基因座类似。这些发现共同表明，鸡基因组中存在多个允许性基因座可用于稳定、功能性Cas9整合。
该研究的局限性包括所有实验均在单一永生化细胞系和体外条件下进行，其向其他细胞类型或体内应用的普适性有待进一步验证。此外，虽然GAPDH在本研究中表现出良好的敲入位点特性，但与其他持家基因或候选安全港位点的比较分析将有助于验证该策略的通用性。尽管存在这些限制，该研究为禽类系统中安全、可预测的转基因整合建立了概念验证框架，为推进家禽生物技术的发展奠定了重要基础。
