《npj Antimicrobials and Resistance》：Survival of ampicillin-treated uropathogenic Escherichia coli is independent of single-cell growth rates
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本研究针对细菌持久性（persistence）形成的传统"休眠假说"提出挑战，通过对尿路致病性大肠杆菌（UPEC）的单细胞分析发现，氨苄青霉素耐受菌的存活与生长速率无关。研究人员利用微流控技术和延时显微镜证实，大多数存活细胞在抗生素暴露时正常生长分裂，而休眠细胞反而易被杀死。这一发现发表于《npj Antimicrobials and Resistance》，为理解抗生素耐受机制和应对耐药性提供了新视角。
抗生素耐药性正成为全球公共卫生的重大威胁，据预测到205年将导致超过1000万人死亡。在这一严峻背景下，细菌持久性（persistence）现象——即少量细菌细胞能在致死剂量抗生素暴露下存活的能力——日益受到关注。这些"持留菌"并非遗传性耐药菌，而是通过进入一种特殊的生理状态来躲避抗生素杀伤，待抗生素清除后又能重新生长，导致感染复发和治疗失败。传统观点认为，持留菌的形成与细菌休眠状态密切相关，因为抗生素主要靶向生长活跃细胞的代谢过程，休眠细胞因代谢活性低而更易存活。这一假说自1944年Bigger首次描述"部分杀伤"现象以来，已主导该领域数十年。
然而，这一经典理论正受到新研究的挑战。最近发表在《npj Antimicrobials and Resistance》上的一项研究，通过先进的单细胞分析技术，对尿路致病性大肠杆菌（UPEC）的氨苄青霉素耐受机制进行了深入探索，得出了令人意外的结论。UPEC是尿路感染（UTI）的主要病原体，约占75%的病例，全球有约1.5亿人受其影响，尿路感染也是抗生素处方的第二大常见原因。这类感染具有高复发率和持久性特点，与持留菌的存在密切相关。
为探究生长速率对抗生素持久性的影响，研究人员选择了一株临床分离的UPEC菌株CFT073作为研究对象。值得一提的是，此前大多数持留菌研究使用的是实验室驯化的大肠杆菌菌株（如MG1655）及其高频持留（hip）突变体，这些菌株可能无法完全反映临床病原体的真实情况。本研究则直接采用临床分离株，更贴近实际感染环境。
研究人员主要运用了几项关键技术：微流控细胞捕获装置实现单细胞水平的长期观测；时间推移显微镜技术每4-5分钟记录一次细胞行为；黄色荧光蛋白（YFP）标记便于追踪细胞命运；最可能数（MPN）法替代传统菌落形成单位（CFU）计数，减少检测过程中对脆弱细胞的损伤；同时构建了rpoS-mCherry和ptolC-mCherry等报告基因菌株，实时监测σ因子（RpoS）和外排泵（TolC）的表达动态。
UPEC在氨苄青霉素暴露期间的持久性
研究首先通过时间杀伤实验证实，UPEC菌株CFT073对氨苄青霉素的耐受性与非致病性大肠杆菌MG1655相似，均呈现双相杀灭动力学特征。通过微流控装置观察2,3350个单细胞的命运，研究人员精确量化了细胞裂解动力学。结果显示，早期裂解速率（kfast）为0.051 min-1，而持久期的裂解速率（kslow）降至0.013 min-1。值得注意的是，微流控装置中观察到的细胞裂解程度低于批量培养中的CFU减少量，提示传统CFU计数方法可能因操作过程中的额外杀伤而低估真实存活率。
UPEC持久性与单细胞生长速率无关
研究最关键的发现挑战了传统认知。通过比较氨苄青霉素暴露前单个细胞的生长速率，发现存活细胞与死亡细胞在暴露前的生长速率分布高度重叠（M9培养基中存活细胞中位生长速率0.009 min-1vs 死亡细胞0.01 min-1）。大多数存活细胞（20/24）在抗生素暴露时正常生长分裂，而非处于休眠状态。相反，大多数不生长细胞（12/16）和所有倍增时间大于120分钟的缓慢生长细胞（17/17）均被氨苄青霉素杀死或无法在抗生素撤除后恢复生长。统计分析表明，存活细胞与非存活细胞在暴露前的生长速率无显著差异（P=0.16，Mann-Whitney检验）。
αMG影响批量培养中的生长和杀灭动力学
为调控生长速率，研究人员在M9基本培养基中添加了非代谢性葡萄糖类似物α-甲基葡萄糖苷（αMG）。如预期那样，添加40倍αMG显著降低了细菌生长速率（M9：k=0.015 min-1；M9+40X αMG：k=0.0023 min-1）。批量培养实验中，αMG的添加提高了持久菌比例（250-700倍），这与实验室大肠杆菌菌株的报道一致，似乎支持生长速率影响持久性的传统观点。
生长调控影响微流控装置中细菌对氨苄青霉素的存活
然而，单细胞水平分析揭示了更复杂的情况。在微流控装置中，虽然αMG减缓了氨苄青霉素介导的裂解，但存活细胞与前暴露生长速率的相关性很弱（Spearman相关系数r=0.199 for M9；r=0.116 for M9+40X αMG）。在不同生长条件下，存活细胞既来源于生长细胞也来源于非生长细胞，且大多数存活细胞（M9：88.7%；M9+40X αMG：73.3%）在抗生素暴露前正常生长分裂。
RpoS不是指数生长期细胞对抗氨苄青霉素存活所必需
应激反应σ因子RpoS在细菌应对环境压力中起关键作用。本研究发现在缓慢生长条件下（添加αMG），RpoS表达水平升高，且群体水平的存活概率更高。但单细胞分析显示，存活细胞与非存活细胞在暴露前的RpoS-mCherry水平无显著相关性。更重要的是，rpoS基因敲除菌株的氨苄青霉素杀灭动力学与野生型无显著差异，表明RpoS在UPEC的氨苄青霉素耐受中并非关键因素。
外排活性不参与对抗氨苄青霉素的存活
药物外排泵AcrAB-TolC已知能降低细胞内抗生素浓度，促进细菌在药物压力下存活。本研究通过ptolC-mCherry转录融合株监测外排活性，发现虽然群体水平上外排活性升高与存活概率增加相关，但单细胞水平上存活细胞与非存活细胞的ptolC-mCherry表达水平无显著差异。暴露于氨苄青霉素后，部分细胞中ptolC-mCherry出现异质性诱导，但存活细胞与非存活细胞在暴露后的表达水平也无差异。
研究结论与讨论部分指出，这些发现支持了日益增长的共识：持久性并非仅与休眠状态相关，而是源于细菌细胞对抗生素应激的多元化动态响应。这一观点与最近在沙门氏菌、分枝杆菌等其他细菌中的研究结果一致。
研究观察到的一些现象尤其值得关注：部分存活细胞在抗生素暴露期间经历了剧烈的形态变化，转变为L型或阿米巴样形状。这些细胞壁缺陷型细菌可能对传统CFU计数方法中涉及的离心、洗涤和固体培养基恢复过程特别敏感，这或许能解释为何单细胞显微镜观察与MPN法得出的存活率估计值更为一致，而与传统CFU计数法存在差异。
在尿路感染背景下，UPEC可在膀胱上皮内形成静止的细胞内储库（QIR），这些储库被认为是复发性尿路感染的主要原因。QIR的形成前涉及细菌群体的活跃生长和复制，随后渗透至更深层组织。它们的细胞内生态位及其静止生理状态使其能够抵抗抗生素治疗并逃避宿主免疫应答，与休眠细菌群体中观察到的抗生素耐受状态相似。
该研究的深刻临床意义在于：持留菌或耐受亚群促进耐药性进化的能力凸显了应对这一挑战的紧迫性。未来研究需将单细胞技术与微组织模型相结合，以全面表征持留菌机制谱系。这种全面理解对于开发新型抗持留菌化合物（例如靶向不依赖能量的细胞过程的化合物）或实施抗生素给药策略以防止感染复发和对抗日益增长的抗菌素耐药性威胁至关重要。
本研究通过先进的单细胞技术揭示了细菌抗生素耐受机制的复杂性，挑战了长期存在的"休眠假说"，为临床应对持久性感染提供了新的理论基础和实验依据。随着研究方法的不断进步，如pSCRATCH等新型工具能够遗传标记持留菌，科学家将能更深入地探索这一领域，为最终解决抗生素耐受性问题开辟新的道路。
