接合型基因驱动系统pPro-MobV通过CRISPR介导的同源定向删除技术高效抑制细菌抗生素耐药性

《npj Antimicrobials and Resistance》：A conjugal gene drive-like system efficiently suppresses antibiotic resistance in a bacterial population

本研究针对抗生素耐药性（AR）这一严峻公共卫生威胁，开发了一种基于CRISPR的接合型基因驱动系统pPro-MobV。该系统通过将前噬菌体λRed同源重组系统、Cas9核酸酶及靶向bla基因的sgRNA整合至单一接合质粒，实现了在细菌群体间高效传播并精准敲除耐药基因。研究揭示了CRISPR切割诱导的同源删除（HBD）新机制，该机制不依赖细菌RecA通路，可通过质粒或噬菌体递送，为耐药基因的靶向清除及基因驱动系统的安全调控提供了新工具。

抗生素耐药性（Antibiotic Resistance, AR）正成为全球公共卫生领域的重大挑战，每年导致约127万人死亡，若不加以控制，预计到2050年这一数字将突破千万。细菌通过基因突变或水平基因转移获得耐药性，其中携带耐药基因的质粒在菌群间传播是加剧AR扩散的关键因素。面对传统抗生素研发瓶颈，亟需开发能够精准靶向并清除耐药基因的新型策略。

在这项发表于《npj Antimicrobials and Resistance》的研究中，研究人员构建了一种名为p^Pro-MobV的接合型基因驱动系统。该系统将阿拉伯糖诱导的λRed-Cas9操作子、靶向^bla基因（介导氨苄青霉素耐药）的sgRNA表达盒以及源于IncP RK2接合系统的转移 machinery整合至一个约65 kb的单一质粒。当该质粒通过接合作用从供体菌（E. coliEPI300）转移至携带高拷贝靶质粒p^ETas（含Amp^R和Sm^R标记）的受体菌（E. coliMG1655）后，诱导λRed和Cas9表达可引发两种并行编辑机制：Pro-AG（原核主动遗传学）介导的sgRNA表达盒精准插入使^bla基因失活，以及新型HBD（同源定向删除）机制——通过CRISPR切割位于短直接重复序列间的靶点，触发同源重组精确删除约1.2 kb的^bla编码区。实验表明，p^Pro-MobV可降低受体菌中Amp^R菌落形成单位（CFU）3-5个数量级，且HBD效率在RecA缺陷菌株中进一步提升。研究还验证了通过工程化λ噬菌体递送sgRNA可实现等效的基因清除效果，为耐药基因的靶向干预提供了多平台解决方案。

关键技术方法包括：① 构建含接合转移元件的单一质粒系统；② 通过qPCR量化质粒拷贝数对编辑效率的影响；③ 建立接合转移与转导实验体系；④ 利用Sanger测序和深度测序分析编辑事件；⑤ 通过λRed/RecA基因敲除菌株解析DNA修复通路作用。所有实验均使用E. coliMG1655野生型及ΔrecA菌株，在30°C低盐LB培养基中完成。

Consolidating multiple Pro-AG components into a single plasmid

研究发现，将Pro-AG核心组件（λRed-Cas9、sgRNA）整合至单一质粒时，其编辑效率受质粒拷贝数显著影响。当使用低拷贝复制子（ori pSC101，~1拷贝/细胞）时，阿拉伯糖诱导后可实现Amp^RCFU降低约1000倍，且所有Sm^R菌落均携带精准插入的sgRNA盒。而中高拷贝质粒（ori p15A、pBBR1）虽仍可介导编辑，但效率随拷贝数升高而递减，证明供体/靶质粒拷贝数差异是驱动Pro-AG自我扩增的关键。

Conjugal transfer of a Pro-AG cassette efficiently reduces AR by two distinct reinforcing mechanisms

p^Pro-MobV通过接合转移至受体菌后，可同时激活Pro-AG和HBD两种机制。测序显示，约20%的Sm^R菌落为典型Pro-AG事件（sgRNA盒插入），80%为HBD事件（精确删除^bla基因）。HBD由Cas9切割位于两个直接重复启动子间的靶点触发，最终形成仅保留Sm^R基因的缺失型质粒p^ETs。

HBD is independent of bacterial RecA activity and enhanced by λRed

在ΔrecA受体菌中，p^Pro-MobV介导的Amp^RCFU降低幅度达10⁵倍，且HBD占比升至75%。缺失实验表明，Cas9为HBD必需，而λRed可显著提升其效率。即使在λRed/RecA双缺失背景下，仍存在基础水平HBD，推测与DNA复制滑移机制相关。

HBD-mediated precise deletion restores ^blafunction

研究人员进一步设计"逆转"实验：将GFP表达盒插入^bla基因并两侧设置100 bp直接重复序列，通过sgRNA-GFP引导切割可实现近100%的^bla功能恢复。该策略为基因驱动系统提供了可控"安全开关"。

Phage delivery of HBD-inducing sgRNA

利用改造的λ噬菌体递送sgRNA-GFP，感染携带靶质粒的菌株后，可高效触发HBD并恢复Amp^R。所有测序菌落均显示精确的GFP盒删除，证实噬菌体可作为CRISPR组件的正交递送载体。

本研究开发的p^Pro-MobV系统首次将接合转移、CRISPR编辑与同源重组删除机制整合，实现了对耐药基因的高效、定向清除。其创新点在于：① 揭示CRISPR切割诱导的HBD新通路，不依赖RecA且可由λRed增强；② 提供质粒/噬菌体双递送平台，扩展体内应用场景；③ 建立可逆编辑系统，为基因驱动安全性设立新标准。该技术不仅为控制耐药菌传播提供新工具，更为微生物组工程、环境修复等领域的精准基因组编辑奠定了方法学基础。