基于膜界面3D SERS基底的单细胞空间分子谱分析技术

《npj Biosensing》：Spatial molecular profiling of living single-cell by membrane-interfaced 3D SERS substrates

本研究针对活体单细胞空间分子异质性分析中标记依赖、信号稳定性差等难题，开发了一种膜界面3ES基底，通过三维金-二氧化硅纳米结构诱导细胞膜包裹形成稳定热点界面，实现了活细胞膜关联分子的无标记二维空间映射。该平台展现出6.9%的信号相对标准偏差，结合层次聚类分析揭示了单细胞内抗氧化态、核苷酸代谢及膜脂组成的空间异质性，为癌症分型与药物响应监测提供了新工具。

在生物学与医学研究中，单细胞异质性被视为理解疾病机制和开发精准疗法的关键。细胞膜作为细胞与外界环境交互的前哨，其表面生化分子的空间分布直接影响细胞功能，但传统荧光技术需标记处理且可能干扰细胞自然状态，而普通拉曼光谱则因信号微弱难以实现活细胞的高通量空间分析。表面增强拉曼散射（SERS）技术虽能通过等离子体热点增强信号，但纳米颗粒在生物环境中的聚集不稳定性和细胞内吞作用导致的信号变异，限制了其在单细胞空间分析中的可靠性。

为解决这一难题，研究团队在《npj Biosensing》发表论文，提出了一种膜界面三维金-二氧化硅SERS基底。该基底通过周期性多层纳米天线结构（Au-SiO₂-Au）诱导细胞膜主动包裹纳米突起，形成稳定的膜-热点界面，结合785 nm近红外激光激发有效降低光毒性，实现了对活体单细胞膜关联分子的无标记二维空间映射。研究通过有限时域差分法（FDTD）模拟验证了基底在细胞膜折射率（1.33-1.58）变化下的宽带等离子体共振特性，其增强因子达4.5×10⁶，且映射信号相对标准偏差仅为6.9%，显著优于胶体SERS系统。

关键技术方法

研究通过软光刻技术制备周期400 nm的纳米柱阵列模板，采用电子束沉积交替堆叠金（30 nm）与二氧化硅（6/8/12 nm）层构建三维纳米天线，并通过缓冲氧化物蚀刻暴露等离子体热点。单细胞培养于基底后，利用水浸物镜进行40×40 μm²区域的SERS映射，每像素积分1秒，结合层次聚类分析（HCA）自动识别分子域。

基底表征与性能验证

扫描电镜与原子力显微镜显示纳米天线阵列均匀分布，交叉截面聚焦离子束扫描电镜（FIB-SEM）证实垂直堆叠结构。以苯硫酚（BZT）为模型分子，映射显示1077 cm^?1峰强度相对标准偏差为6.9%，证实热点均匀性。FDTD模拟表明基底在785 nm激发下电场强度最大|E|²达1020，且折射率敏感性低，保障了细胞环境下的信号稳定性。

单细胞空间分子谱分析

以MCF-7乳腺癌细胞为模型，SERS映射捕获到679 cm^?1（谷胱甘肽相关振动）、726 cm^?1（腺嘌呤环呼吸模式）和1121 cm^?1（磷脂C-C伸缩）等特征峰，其空间分布显示分子在细胞膜区域呈异质性聚集。活/死实验证实基底生物相容性，且细胞形态在测量过程中未发生显著漂移。

层次聚类解析分子域

HCA将光谱数据划分为三类分子簇，其空间分布与细胞形态高度吻合。簇平均光谱显示不同区域在抗氧化代谢（679 cm^?1）与核苷酸活动（726 cm^?1）方面存在显著差异，红色簇（簇3）更倾向于捕获膜脂筏等局部信号枢纽，印证了膜功能区域化理论。

结论与展望

该研究通过三维纳米拓扑结构驱动的膜-热点界面，实现了活细胞膜关联分子的无标记空间分析，为单细胞水平研究药物响应、癌症异质性等提供了可靠平台。未来结合时间分辨测量与人工智能解析，有望进一步揭示动态生物过程中的分子调控机制。需注意，该技术对细胞粘附性具有依赖性，且峰归属需通过界面兼容性验证手段进一步确认。