《Cancer Research》：Integrative Multiomics and Drug Sensitivity Profiling Reveal Potential Biomarkers and Therapeutic Strategies in Pediatric Solid Tumors
Open Access
Abstract
儿童恶性肿瘤的治愈率通过现有治疗方案已平均提升至80%，但进展陷入平台期。高危髓母细胞瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、高危神经母细胞瘤和高级别胶质瘤等患儿的生存率极低，复发患者预后更差。INFORM项目建立了儿童实体瘤和脑肿瘤的功能性药物反应分析平台，旨在识别患者特异性脆弱性和生物标志物，并阐明与药物反应谱相关的分子机制以促进临床转化。本研究对81例儿童实体瘤样本进行了药物敏感性、基因组和转录组数据的多组学分析。整合分析提示两个多组学特征与药物敏感性相关：一个特征区分了对BCL2家族抑制剂navitoclax敏感的神经母细胞瘤样本；另一个特征特定于携带SIX1（Q177R）热点突变的肾母细胞瘤亚群，该亚群显示MGAM、PTPN14、STAT4和KDM2B高表达，且对MEK抑制剂高度敏感。患者特异性因果相互作用网络分析提示了肾母细胞瘤样本中MEK抑制剂与SIX1突变之间可能的分子相互作用。综上，药物敏感性分析与多组学数据的整合揭示了儿童实体瘤中可能与药物敏感性相关的潜在生物标志物。
Introduction
儿童肿瘤约占所有肿瘤诊断的1%，却是儿童疾病相关死亡的主要原因。儿童癌症的基因组和转录组景观与成人恶性肿瘤显著不同。巨大的肿瘤间异质性和成人中几乎不发生的肿瘤类型促使了首个世界卫生组织儿童肿瘤分类的发展。该分类基于考虑分子谱、免疫组织化学和形态特征的多层策略。分子分析能够实现更精细的肿瘤分类，划分为具有潜在预后和预测相关性的分子定义亚组。
历史上，儿童癌症治疗的进步主要集中在发现和开发多模式治疗方案，包括手术切除、放疗、细胞毒性疗法组合以及加强支持治疗措施。近来，创新重点已转向基于作用机制的药物和免疫肿瘤学方法。近年来，儿童精准肿瘤学的显著进步促使启动了多个大型国家和国际精准肿瘤学项目。这些项目成功招募了数千名儿童、青少年和年轻成人参与者，标志着向更多基于作用机制的治疗策略的关键转变。在这些努力中，探索了分子驱动精准医学的潜力，并评估了分子靶向治疗的临床益处。
多组学方法通过利用基因组、转录组和蛋白质组数据，彻底改变了精准肿瘤学，增强了肿瘤分类，并加深了我们对肿瘤内异质性的理解。功能性精准医学使用类器官和患者来源细胞也已被证明是可行的，这些模型能更准确地复制患者特异性肿瘤环境和药物反应。此外，将药物反应分析与多组学数据整合可以改善潜在治疗靶点和特异性脆弱性的识别。值得注意的是，尽管这种整合已在儿童血液肿瘤中进行了探索，但在儿童实体瘤中的研究仍然较少。我们的研究旨在通过将这些整合方法应用于儿童实体瘤来填补这一空白，可能发现独特的生物标志物。
儿童复发恶性肿瘤个体化治疗（INFORM）是一个针对高危复发/难治性恶性肿瘤儿童的国际精准肿瘤学登记项目。该项目旨在将下一代分子诊断转化为生物标志物驱动的治疗策略。截至2022年1月本研究数据冻结时，INFORM登记处已纳入近2000名患者，超过1200个样本使用下一代测序和微阵列技术进行了分子分析。在INFORM项目内，海德堡Hopp儿童癌症中心转化药物筛选部门建立了一个儿童实体瘤和脑肿瘤的体外功能性药物敏感性分析平台，旨在用每个患者的功能性药物敏感性数据补充INFORM登记处建立的分子谱。DSP项目旨在识别与药物敏感性谱相关的新生物标志物和分子机制，并促进直接临床转化。截至2022年1月，DSP项目已筛选了96名患者的肿瘤，使用包含79种临床相关药物的药物库进行测试。
儿科INFORM登记处能够在50%的病例中识别分子药物靶点；然而，迄今为止，只有5%至10%具有强致癌驱动因素（包括NTRK、BRAF和ALK改变）的病例被证明能从分子匹配的靶向治疗中获益。值得注意的是，对于频繁应用的靶向药物（包括MEK、CDK和mTOR抑制剂）的反应预测生物标志物在很大程度上是缺乏的。因此，利用INFORM体外药物敏感性数据集，我们旨在将肿瘤的多组学景观与其体外药物敏感性谱整合，以识别与药物反应相关的生物标志物并阐明分子机制。作为一项探索性分析，本研究旨在生成假设并识别有前景的分子和药物反应特征，为儿科精准肿瘤学的进步奠定基础。
Materials and Methods
Ex vivoDSP
我们使用内部方案筛选了96个患者样本和13个非恶性对照。体外球体培养72小时，接种在圆底384孔板中。所有板均针对79种临床相关药物进行筛选，每种药物五个浓度，重复两次。使用CellTiter-Glo 2.0进行ATP细胞活力测定。
DSP analysis
使用iTReX分析原始药物筛选数据。分析步骤包括：i) 针对BztCl和DMSO的阳性和阴性对照孔对原始活力测量值进行归一化；ii) 质量控制。计算并应用稳健z prime、重复间的Pearson相关性和阴性对照孔的原始计数值作为质量控制参数，将样本分类为“高”、“中”、“边界”和“失败”质量组。只有中、高质量筛选被纳入下游药物敏感性分析。iii) 使用五参数逻辑反应模型拟合剂量反应曲线；iv) 使用非对称药物敏感性评分量化药物敏感性。通过从肿瘤样本的DSSasym中减去非恶性对照的平均值来计算选择性药物敏感性评分。准备患者×药物sDSSasym矩阵用于进一步下游分析。
Variant calling
使用DKFZ内部工作流程处理INFORM登记研究的WES数据。使用SNVCalling工作流程识别单核苷酸变异，使用IndelCalling工作流程识别小插入/缺失。使用ANNOVAR对变异进行功能注释。排除在exac03中人群频率≥0.01或在ClinVar中注释为“良性”、“可能良性”或“意义不确定”的变异。
Copy-number variation analysis
使用CNVkit从WES数据中调用拷贝数变异，使用默认参数。使用CNVkit cnr输出文件中的Log2拷贝数比值。
RNA-seq workflow
使用DKFZ One Touch Pipeline RNA-seq工作流程处理RNA-seq数据。使用STAR比对器将reads映射到参考基因组。使用featureCounts进行基因水平read计数，聚焦于GENCODE v19中定义的外显子区域。基因表达计算为TPM值，并在INFORM数据集中进行z转换。
Gene fusion calling
使用Arriba从RNA-seq数据中识别基因融合。仅包括Arriba报告的高、中置信度的基因融合用于进一步分析。
Multiomics factor analysis
本研究采用与组织学无关的分析方法，使用多组学因子分析（MOFA+）应用于76个具有重叠组学和药物敏感性数据的样本的全队列。该策略旨在识别可能揭示药物反应模式和肿瘤特异性特征的潜在因子。通过仅保留影响致癌和/或可成药基因的事件来减少分子数据视图中的特征数量。我们编制了此类基因的列表，作为与癌症易感性或进展相关、具有可操作治疗意义或具有已知药物-基因相互作用的基因的并集。每个MOFA视图准备为矩阵输入，行为特征，列为样本ID。
MOFA+ factors selection and downstream analysis criteria
根据因子对药物敏感性数据方差的贡献（≥5%）进行过滤。优先考虑药物反应方差解释超过10%的因子，确保识别有意义的敏感性模式。通过分析每个因子中药效反应特征的权重来验证识别的因子。因子1和3基于存在高权重药物（权重>0.7）而被优先考虑。
Pathway activity analysis
使用PROGENy从基因表达数据中识别通路足迹。PROGENy专门设计用于从基因表达数据估计通路活性，包括一组预定义的14条信号通路。使用每个通路最显著的100个基因的归一化TPM表达值计算通路活性分数。
Transcription factor activity
使用DoRothEA R包从基因表达TPM值计算转录因子活性评分。选择置信度为A、B和C的TF靶标相互作用，得到289个TF调节子。使用VIPER运行DoRothEA，使用缩放方法计算单样本特征，每个调节子允许最少4个靶标。
CARNIVAL analysis
使用CARNIVAL将我们的功能性药物反应谱和组学数据情境化为因果网络。使用基于患者基因组谱的功能性SNV、InDel突变和融合的约束设置构建样本特异性先验知识网络。使用OmniPath R包的“import_all_interactions”函数整理先验知识。使用CPLEX求解器解决优化问题。
Results
Integrated analysis of drug screening and omics data reveals subsets of tumors with specific therapy sensitivities
高通量测试79种化合物库用于建立96个INFORM儿童实体瘤和脑肿瘤的体外药物敏感性谱。根据药物筛选质量控制标准，我们将47个药物筛选分类为高质量，34个为中等质量，而15个样本表现出边界或低质量并被排除在进一步分析之外。纳入进一步分析的81个样本属于24个不同癌症实体的分子亚组。基于选择性药物敏感性评分指标评估敏感性。根据样本间反应相似性对药物敏感性模式进行列聚类，根据药物在队列中的敏感性谱进行行聚类。通过药物敏感性谱对肿瘤进行聚类，揭示了尤文氏肉瘤和一种罕见的脑肿瘤类型室管膜瘤具有相似的药物敏感性模式。其他实体，如肾母细胞瘤，显示出不止一个药物敏感性模式簇，表明肿瘤类型内存在分子多样性，从而增加了为此类簇识别可成药靶点的潜力。
为了探索表型药物筛选和组学数据的组合变异性，我们收集了所研究INFORM样本的组学数据，包括五个不同的数据层，最终得到76个在药物筛选和组学数据上有交集的样本。数据视图包括功能性小体细胞突变、基因组CNV、基因表达值、基因融合和药物反应谱。我们使用MOFA+分解不同的数据层。训练模型捕获了九个MOFA潜在因子，每个因子在至少一个数据层中代表至少5%的方差。九个因子对每个数据层的累积方差解释分布如下：RNA表达数据39%，药物反应层29%，基因融合15%，CNV 9%，突变层5%。
在MOFA+分析中，每个“因子值”代表给定样本中特定潜在因子的活性水平。较高的因子值表示该因子对样本的活性或影响增加，反之亦然。通过检查每个因子的样本分布，我们识别出四个实体特异性因子。值得注意的是，其中两个因子在药物反应数据层中解释了相当大比例的方差。因子1主要由肾母细胞瘤样本驱动，而因子3主要由神经母细胞瘤样本驱动。
因子2和5分别显示出对尤文氏肉瘤和BCOR肉瘤的实体特异性样本贡献。两个因子在其方差中都有基因融合的强贡献。基于融合数据层中的最高权重，因子2由尤文氏肉瘤的典型EWSR1融合驱动，而因子5由定义BCOR肉瘤的BCOR融合驱动。
我们探索了显示显著变异性数据层中权重最高的特征，特别关注与药物反应谱高度相关的因子。因子1和3是仅有的两个药物敏感性层贡献超过总方差10%的因子。因子3由四个神经母细胞瘤样本主导，而因子1由三个肾母细胞瘤样本主导。因子3几乎只解释了药物敏感性和基因表达层的方差。该因子内权重最高的特征是对navitoclax的敏感性以及一组三个基因的高表达。因子1解释了三个数据层的高方差：药物敏感性、突变和RNA表达。因子1中权重最高的药物特征是对trametinib的敏感性。此外，该因子在突变数据层中以SIX1突变为最高权重特征，在RNA表达值层中有一个由MGAM、PTPN14、STAT4和KDM2B高表达组成的基因表达特征。总之，我们的药物敏感性和组学数据整合分析识别出一个神经母细胞瘤亚群，其特征是DUSP8、GATA3和PHOX2B高表达，以及对BCL2家族抑制剂navitoclax敏感。此外，我们识别出一个携带SIX1（Q177R）热点突变的肾母细胞瘤亚群，该亚群显示MGAM、PTPN14、STAT4和KDM2B高表达，并对药物库中所有三种MEKi高度敏感。这些结果表明特定的基于组学的特征可能与神经母细胞瘤中对navitoclax和肾母细胞瘤中对MEKi的敏感性存在关联。
The selective sensitivity of a Wilms tumor subset correlates with distinct omics features
为了阐明所识别的独特组学特征是否赋予神经母细胞瘤和肾母细胞瘤分别对BCL2和MEKi的选择性敏感性，我们可视化了存在的顶级基因表达特征与药物反应相关潜在因子的相关性。我们调查了肾母细胞瘤中SIX1（Q177R）突变状态与对MEKi敏感性之间的关联。分析揭示了药物敏感性的显著差异。我们还分析了我们队列中MEKi的选择性敏感性与四个已识别基因表达水平之间的关联，并结合SIX1突变状态。该分析证明了我们队列中SIX1突变、基因表达和MEKi敏感性之间的特异性关联。
为了验证这些发现，我们分析了来自TARGET队列的独立儿童肾母细胞瘤数据集。该队列包括n = 101个肾母细胞瘤样本，其中四个携带SIX1（Q177R）突变。与SIX1野生型病例相比，在SIX1突变样本中观察到三个基因的表达显著增加。尽管PTPN14在SIX1突变样本中表现出更高的表达，但差异不显著，可能反映了其表达的异质性或关联性较弱。这一独立验证加强了SIX1突变状态与这些基因表达之间的关联，尽管需要进一步研究以确定它们在肾母细胞瘤中的预测价值。
类似地，我们探索了神经母细胞瘤样本中navitoclax敏感性与一组基因表达水平之间的相关性。尽管神经母细胞瘤样本中navitoclax敏感性和三个基因的表达都很高，但没有一个基因与navitoclax敏感性显示出显著相关性，表明我们数据集中捕获的敏感性与特定的基因表达特征没有直接联系。
为了验证在神经母细胞瘤中观察到的药物敏感性特征，我们将分析扩展到GDSC2数据集中的神经母细胞瘤细胞系数据。为了评估神经母细胞瘤细胞系与原发性肿瘤组织的相似性，我们使用Cancer Dependency Map算法识别与肿瘤组织转录距离最近的神经母细胞瘤样本。该分析识别出19个神经母细胞瘤细胞系，其转录谱与癌症基因组图谱队列的肿瘤组织一致。这些神经母细胞瘤细胞系在Cancer Dependency Map门户中显示出比所有其他实体显著更高的GATA3和PHOX2B平均表达。使用GDSC2 AUC值进行的药物反应双向比较分析显示，BCL2家族抑制剂是神经母细胞瘤细胞系中顶级选择性药物敏感性之一。神经母细胞瘤模型中的navitoclax反应显示出与其他癌症类型不同的AUC分布，表明存在谱系相关的药物敏感性模式。此外，神经母细胞瘤细胞系在GDSC2数据集中对alisertib、MST 312和APO 866具有选择性敏感性；然而，这些化合物未包含在INFORM药物库中。在使用GDSC2数据集比较神经母细胞瘤的药物敏感性与基因表达特征时，未观察到两个事件之间的相关性。这一发现揭示，尽管BCL2家族抑制剂敏感性和高基因表达在神经母细胞瘤中都很重要，但它们是独立的现象。
总之，我们的分析识别出SIX1突变的存在与MGAM、PTPN14、STAT4和KDM2B表达水平升高之间存在稳健关联，这些与肾母细胞瘤样本亚群中的MEKi敏感性紧密相关。相比之下，尽管在神经母细胞瘤样本中观察到了navitoclax敏感性，但未发现药物敏感性与特定基因表达特征之间的直接相关性。使用GDSC2数据集的验证证实，神经母细胞瘤对BCL2家族抑制剂的药物敏感性和基因表达模式是独立的现象。我们的观察强烈表明，特定的组学特征可用于预测肾母细胞瘤中MEKi的体外敏感性。
Network inference provides mechanistic context for specific drug responses and multiomics signatures in Wilms tumors
接下来，我们旨在阐明肾母细胞瘤病例中特异性药物敏感性及相关特征的机制。我们使用CARNIVAL管道构建患者特异性信号网络。使用约束设置从OmniPath数据库为每个患者构建先验知识网络。该约束设置通过排除未表达基因并整合SNV、InDel和基因融合信息以调整网络结构，从而为每个样本单独优化网络。
为了探索trametinib与SIX1突变之间的关系，我们分析了三个携带MEKi-SIX1特征的肾母细胞瘤样本的患者特异性网络中报告的共同相互作用。在我们的研究中，我们通过观察其节点之间连接性的变化来识别网络内的共同模式。为了缩小潜在相关相互作用的范围，我们寻找在三个非SIX1突变且未显示MEKi敏感性的肾母细胞瘤中明显缺失或未表现出活性的相互作用。由此，我们识别出显示MEKi-SIX1特征的肿瘤所特有的特异性相互作用。我们利用OmniPath提供的综合资源来阐明生物通路和相互作用，从而在我们的网络图中建立这两个关键节点之间的直接关系。因此，我们旨在提供一个清晰的、基于证据的图示，说明SIX1和MEK1/2在更广泛的细胞背景中如何相互作用。该可视化旨在阐明SIX1、MAP2K1/2和MAPK14在整体分子网络中的关系。SIX1和MAPK14通过AKT1连接。几个TF节点显示了AKT1与MAPK14/MEK节点之间的联系。此外，KDM2B在MPK14-TCF3和AKT1-ETS1活性之间显示出相互作用，这可能解释了MEKi敏感性、SIX1突变和KDM2B过表达之间的关联。
Discussion
为了增进我们对与药物反应相关的分子机制的理解，我们将MOFA应用于INFORM体外药物筛选数据集，该数据集包含来自儿科患者的76个实体瘤和脑肿瘤的药物筛选和组学数据。使用MOFA，我们确认了先前已知的临床异质性分子驱动因素，并识别出两个主要由肾母细胞瘤和神经母细胞瘤驱动的潜在因子作为药物反应模式。尽管这种亚组优势限制了这些发现的普适性，但它强调了即使在小型和异质性队列中也能识别临床可操作见解的可行性。未来需要更大、亚型特异性队列的研究来验证这些观察结果。尽管肿瘤亚组的样本量存在固有的局限性，但本研究中获得的见解为功能性精准肿瘤学的未来研究奠定了基础。
第一个潜在因子特定于四个神经母细胞瘤样本，其中该因子包括navitoclax敏感性作为最高权重的药物反应特征。然而，我们的分析未揭示navitoclax敏感性与DUSP8、GATA3和PHOX2B基因表达之间的任何显著相关性。尽管GATA3先前已被确定为神经母细胞瘤的标志物，并且神经母细胞瘤样本中DUSP8和PHOX2B的高表达已有报道，但我们的研究结果表明这些基因并不能直接预测navitoclax敏感性。这些结果凸显了需要研究驱动神经母细胞瘤中BCL2家族抑制剂敏感性的替代机制。观察到的navitoclax敏感性可能仍然具有治疗相关性，因为我们在使用GDSC数据集的独立验证中也报告了这一点。然而，需要进一步研究以识别预测标志物或介导此效应的通路。
第二个潜在因子由三个对MEKi高度敏感的肾母细胞瘤样本驱动。该因子由SIX1基因突变和一组在这些样本中高表达的基因定义。体细胞SIX1突变，特别是SIX1同源域中的热点突变，已知影响具有高增殖潜力的肾母细胞瘤亚群，但SIX1突变的肾母细胞瘤尚未在文献中与MEKi敏感性相关联。这种关联暗示了一个潜在的治疗途径和候选生物标志物，尽管需要进一步的功能研究来确认其临床相关性。此外，本研究中识别的高表达基因均未与MEKi反应相关联。这不仅表明该基因表达特征未来可用作新的预测生物标志物，还可能增进我们对使肿瘤对MEKi敏感的机制的理解。
我们为队列中的肾母细胞瘤样本构建了患者特异性信号网络，以将SIX1突变、MEKi敏感的肾母细胞瘤的特定多组学特征置于生物学背景中。这使得能够进行SIX1突变与SIX1野生型肾母细胞瘤的比较分析，这与提供广泛景观的基于队列的推断网络不同。我们识别出SIX1突变样本中常见的上调节点活性，这些活性可能潜在解释MEKi与SIX1突变状态之间的机制相互作用。Trametinib抑制MAPK14调控位点的磷酸化。Yu及其同事已表明SIX1诱导特定细胞周期蛋白基因的表达并刺激MAPK和AKT活性。AKT1在CARNIVAL网络的共同节点中被捕获为成肌细胞决定蛋白1的主要调节因子，之前已有报道受SIX1基因调节。这表明AKT1将trametinib–MAPK14相互作用与AKT通路联系起来，从而推定性解释了trametinib敏感性与SIX1突变之间的关联。此外，AKT信号传导增强了SIX1转录共激活因子Eya1的活性。ETS1基因也被捕获为连接SIX1和MAPK14的节点。AKT信号对Eya1的影响，当与SIX1相关联时，指向一个可能影响肾母细胞瘤细胞增殖和存活的关键通路。ETS1作为该网络内的连接器参与，表明它可能在介导这些相互作用对细胞功能的影响中发挥关键作用。这些见解不仅可能加深我们对癌症生物学的理解，还突出了潜在的靶点，并揭示了与药物反应和治疗策略相关的通路的假设。这些发现强调了整合组学分析在精准肿瘤学中的关键作用，促进了从个体患者肿瘤谱衍生的治疗药物靶点复杂分子相互作用的理解。尽管我们的计算分析提供了重要的见解，但验证这些发现至关重要。未来的研究应侧重于功能测定，以测试已识别基因和通路的作用。例如，敲低或过表达实验可以确认KDM2B、AKT通路、ETS1和SIX1在肾母细胞瘤MEKi敏感性中的作用。这些实验验证对于确认计算预测并将这些发现转化为潜在临床应用至关重要。
总之，我们的发现提示了MEKi，特别是trametinib，与SIX1热点突变之间可能存在机制相互作用。网络分析表明AKT1是连接trametinib–MAPK14相互作用
