蛇毒是一种强大的化学武器，使蛇能够制服猎物或抵御捕食者和人类。这些蛇毒是由数百种生物活性蛋白质和肽组成的复杂混合物，它们能选择性地攻击重要器官[1]。蛇毒的分子组成在不同分类水平上存在差异，包括家族间、属间、种间和种内变异[2]。这些差异显著影响了抗蛇毒血清的治疗效果，而抗蛇毒血清至今仍是治疗蛇咬伤最有效的方法[3]。因此，在物种水平上确定蛇毒成分对于开发特异性抗蛇毒血清至关重要，以确保有效应对蛇咬伤。此外，对蛇毒的蛋白质组学分析有助于发现具有潜在治疗价值的新型生物活性蛋白质和肽[4]。此外，蛇毒蛋白质组学研究还有助于理解驱动蛇毒多样性、适应性和物种形成的进化机制[5]。
由于Montivipera物种生活在高海拔地区（因此得名“山地蝰蛇”），人类被咬伤的情况较为罕见。Montivipera蛇毒引起的临床表现包括局部症状（如肿胀、淤血、组织损伤和局部出血），以及全身症状（如止血功能障碍、神经毒性和低血压[10, 11, 12]。重要的是，如果没有及时注射抗蛇毒血清，Montivipera蛇咬伤可能导致长期并发症甚至死亡[11, 13]。目前，除了针对M. xanthina等欧亚蝰蛇的多价抗蛇毒血清外，尚无针对其他Montivipera物种的抗蛇毒血清[14]。因此，对Montivipera蛇毒进行深入的蛋白质组学分析有助于探索现有抗蛇毒血清的交叉反应性，特别是在临床需求有限且商业开发意愿不足的情况下尤为重要。
从功能角度来看，Montivipera蛇毒的研究较少。然而，一些关于其生物活性的研究表明它们具有潜在的生物医学价值。M. raddei和M. bulgardaghica的蛇毒对癌细胞和非癌细胞系表现出细胞毒性，提示它们可能具有抗增殖作用[15]。此外，M. xanthina蛇毒对癌细胞系以及真菌和细菌分别具有细胞毒性和抗菌作用[16, 17]。其中，M. bornmuelleri蛇毒的研究最为深入，发现了多种有趣的生物活性，包括抗菌、促凝血和抗凝血、细胞毒性、免疫调节、神经毒性和血管舒张作用[18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]。这些活性表明Montivipera蛇毒成分的多样性，强调了对其鉴定和表征在 therapeutic 开发和研究应用中的重要性。
最近对四种Montivipera物种（包括M. xanthina、M. bulgardaghica、M. raddei和M. albizona）的蛇毒蛋白质组进行了分析。这些研究表明，这些蛇毒的主要蛋白质家族包括蛇毒金属蛋白酶、蛇毒丝氨酸蛋白酶、磷脂酶A2、C型凝集素和蛇毒血管内皮生长因子[15, 25, 26, 27]。不过，不同研究在鉴定到的蛋白质数量和低丰度蛋白质家族方面存在差异。因此，仍需进一步分析这四种蛇毒的蛋白质组组成，以验证和完善先前的研究结果。此外，M. bornmuelleri蛇毒的组成尚未被分析，仍是一个重要的研究空白。
蛇毒蛋白质组可通过不同的方法进行分析，每种方法各有优缺点[28, 29]。然而，shotgun proteomics是目前解码蛇毒蛋白质组的金标准，因为它提供了一种全面的高通量分析方法，能够同时鉴定（并相对定量）大量蛋白质，无需预先分离毒素。与传统基于凝胶的方法或靶向方法相比，该方法能更全面地覆盖低丰度成分和翻译后修饰，这对于理解蛇毒的复杂性至关重要。这使得它特别适合用于分析如Montivipera物种这类特征不明确的蛇毒。本研究除了采用shotgun proteomics外，还结合了传统的胰蛋白酶消化技术和较新的多酶有限消化（MELD）[30]方法。与传统方法相比，MELD方法减少了样品损失和对高丰度蛋白质的偏好，从而更准确地鉴定低丰度蛇毒成分。通过为每种毒素生成更多重叠肽段，提高了蛋白质序列的覆盖度，使蛇毒毒素的鉴定更加可靠。最近的研究表明，结合胰蛋白酶消化和MELD消化能够获得更全面的蛇毒成分信息[31, 32]。
因此，本研究旨在通过SDS-PAGE、RP-HPLC和shotgun proteomics（结合胰蛋白酶和MELD消化）方法分析上述五种Montivipera物种的蛇毒组成。这不仅首次确定了M. bornmuelleri的蛋白质组组成，还补充和验证了之前发表的M. bulgardaghica、M. albizona、M. raddei和M. xanthina的蛇毒蛋白质组数据。除了揭示Montivipera蛇毒的蛋白质组特征外，我们还对其蛋白质组进行了比较分析，以了解生活在不同地理栖息地的Montivipera物种之间的进化关系。作为对比对象，我们分析了与其亲缘关系密切的Macrovipera lebetina ssp.的蛇毒，以提供系统发育参考。
