《Veterinary Microbiology》：African swine fever virus pNP419L inhibits host translation and increases viral replication through the PERK/eIF2α pathway
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非洲猪瘟病毒（ASFV）NP419L蛋白通过激活宿主PERK/eIF2α通路和诱导内质网应激抑制宿主翻译，并证实其非DNA修复功能对病毒复制的关键调控作用。
王雪莹|王子轩|郭一琳|牛赛|梁瑞|程琳|Hakimeh Baghaei Daemi|彭桂清
中国华中农业大学兽医学院农业微生物国家重点实验室，武汉
摘要
非洲猪瘟（ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的高传染性疾病，对全球养猪业构成了严重威胁。尽管ASFV编码了许多自我维持的蛋白质，但其mRNA的翻译仍依赖于宿主的翻译机制。然而，ASFV编码的蛋白质在感染细胞中调节宿主翻译过程的机制在很大程度上尚未被探索。在这项研究中，我们调查了ASFV编码的蛋白质如何影响宿主细胞的翻译。我们发现了21个ASFV基因（排除了多基因家族中的基因），这些基因显著抑制了Renilla荧光素酶（Rluc）的活性。在这些基因中，只有NP419L显示出强烈的抑制作用。我们发现NP419L能够显著抑制宿主蛋白质的合成，且这种抑制作用与其酶活性无关。本研究利用共聚焦显微镜和生化实验，揭示了ASFV感染的重要机制。我们发现ASFV的pNP419L定位于内质网（ER），诱导了ER应激并激活了PERK/eIF2α通路，从而抑制了宿主的翻译。此外，病毒实验表明，敲低NP419L能有效减少病毒复制并显著恢复宿主基因表达。总体而言，我们的发现加深了对ASFV蛋白如何抑制宿主翻译的理解，并首次揭示了ASFV pNP419L除了DNA连接酶活性之外的新功能，为ASFV感染期间的翻译调控提供了关键见解。
引言
非洲猪瘟（ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的高传染性疾病，影响家猪和野猪，症状包括高烧、出血、共济失调（身体运动控制丧失）和严重抑郁（Tulman等人，2009年）。ASF于1921年首次在肯尼亚被发现，并迅速传播到撒哈拉以南非洲、高加索地区、俄罗斯联邦和东欧的多个地区（Sánchez-Cordón等人，2018年）。中国首例ASF病例报告于2018年，导致一年内超过119.2万头猪死亡，严重危及养猪业和食品安全（Revilla等人，2018年；Zhou等人，2018年；Dixon等人，2019年）。尽管越南使用了一种基因删除的ASFV株（ASFV-G-ΔI177L）作为安全的减毒活疫苗，但最近的研究表明这种疫苗存在显著的安全问题（Van Den Born等人，2025年）。目前，尚无安全有效的ASFV疫苗或治疗方法。
ASFV是Asfarviridae家族的唯一成员，被归类为核质大DNA病毒，也是唯一的DNA虫媒病毒。这种病毒体积庞大且结构复杂，其双链DNA基因组长度在170到190千碱基对（kb）之间，包含151到167个开放阅读框（ORFs）。这些ORFs主要编码结构蛋白、病毒DNA复制蛋白和免疫逃逸蛋白（Reis等人，2017年）。结构蛋白主要包括包膜蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白和DNA结合蛋白。包膜蛋白在病毒出芽过程中从宿主细胞膜中获得，在宿主细胞内的趋向性、致病性和免疫原性中起关键作用（Alejo等人，2018年）。衣壳蛋白如pB646L、pB438L和pE120R是病毒的重要组成部分。其中，pB646L作为主要的核衣壳蛋白，而pE120R有助于病毒的细胞内运输（García-Escudero等人，1998年；Andrés等人，2001年；Epifano等人，2006年）。核衣壳蛋白主要包括多聚蛋白pp220（ORF CP2475L）和pp62（CP530R），它们被病毒蛋白酶pS273R切割成多个成熟产物（Andrés等人，1997年；Andrés等人，2002年）。病毒核仁包含DNA结合蛋白p10和pA104R（Alejo等人，2018年）。与DNA复制相关的基因如G1211R、E301R、C962R和F1055L分别编码DNA聚合酶B、PCNA样蛋白和参与起始复制的蛋白（Martins等人，1994年；Yá?ez等人，1995年；Frouco等人，2017年）。此外，ASFV具有自身的DNA修复机制来修复DNA损伤。ASFV还产生多种蛋白质，调节宿主免疫反应并操控巨噬细胞以增加病毒复制、增殖和感染。这些蛋白质通过对抗I型干扰素反应、抑制细胞凋亡、自噬和炎症反应来发挥作用（Hernáez等人，2004年；Sánchez等人，2013年）。多基因家族MGF360和MGF530以抑制I型干扰素反应而闻名（O’Donnell等人，2015年）。A276R蛋白作为IFN-α和β激活的抑制剂。此外，A179L基因编码一种Bcl2同源物，具有抗凋亡功能，有助于延长宿主细胞的存活时间，直到病毒基因组复制完成（Brun等人，1996年）。
作为细胞内寄生病原体，病毒依赖宿主的翻译机制，通过招募宿主核糖体来翻译其遗传物质以合成自身蛋白质。病毒编码的功能通常用于操控细胞翻译因子和调节宿主信号通路，从而控制翻译过程。这种操控不仅促进了病毒蛋白质的产生，还破坏了宿主旨在抑制感染细胞中蛋白质合成的天然防御机制（Walsh和Mohr，2011年；Jan等人，2016年；Stern-Ginossar等人，2019年）。在环境压力导致的细胞应激下，蛋白质合成会迅速停止，形成应激颗粒。在此过程中，真核生物的翻译起始因子2α（eIF2α）会被磷酸化。在哺乳动物细胞中，有四种激酶可以磷酸化eIF2α，每种激酶由不同的应激刺激激活。例如，血红素调节抑制剂（HRI或eIF2αK1）对氧化损伤或热休克等条件作出反应（Lu等人，2001年；McEwen等人，2005年）。通用控制不可抑制蛋白2（GCN2）由氨基酸缺乏或紫外线损伤激活（Wek等人，1995年；Deng等人，2002年）。相比之下，蛋白激酶R（PKR）由双链RNA激活（García等人，2007年），而类似PKR的内质网（ER）激酶（PERK）则由ER应激刺激（Harding等人，2000年）。当发生ER应激时，会触发哺乳动物细胞的未折叠蛋白反应（UPR），该反应由三种ER跨膜传感器IRE1、PERK和ATF6介导（Galindo等人，2012年；Galindo和Alonso，2017年；Zheng等人，2022年）。PERK通路的激活导致eIF2α的磷酸化，从而抑制宿主蛋白质合成，可能促进病毒复制。在ASFV感染的情况下，宿主蛋白质合成受到显著抑制，而病毒蛋白质的产生仍然高效（Castelló等人，2009年）。ASFV使用多种策略来操控宿主蛋白质合成，包括调节真核生物起始因子如eIF2α、eIF4E和eIF4G，招募eIFs、核糖体和线粒体到病毒复制位点，以及调节RNA代谢（Sánchez等人，2013年）。例如，ASFV蛋白DP71L与三种蛋白磷酸酶1催化亚单位（PP1c）结合，通过招募PP1c促进eIF2α的去磷酸化（Zhang等人，2010年）。病毒的去帽酶g5R蛋白在体外具有去帽活性，影响mRNA代谢（Parrish等人，2009年）。此外，ASFV的泛素连接酶I215L与核糖体蛋白RPS23和帽依赖性翻译起始因子eIF4E相互作用，劫持宿主的翻译机制，从而调节细胞蛋白质表达。尽管有这些发现，许多其他参与控制宿主蛋白质合成的ASFV编码蛋白质仍缺乏研究。
ASFV的NP419L被鉴定为一种DNA连接酶，以其高错误倾向而闻名。这种酶在病毒DNA修复过程中起关键作用，对病毒基因组突变至关重要（Chen等人，2019年）。先前的研究发现NP419L显著抑制了Renilla荧光素酶（Rluc）的活性，表明该蛋白可能具有超出DNA连接酶功能的其它作用。本研究旨在探索这些额外功能。研究结果表明，NP419L强烈抑制宿主细胞翻译和蛋白质合成，并使细胞周期停滞在G0/G1阶段。进一步的研究发现NP419L与内质网（ER）共定位，导致ER肿胀和应激。该蛋白通过激活蛋白激酶PERK/eIF2α/ATF4通路抑制宿主翻译。此外，敲低NP419L或抑制PERK显著减少了ASFV的增殖，表明这种蛋白激酶可能是开发抗非洲猪瘟病毒疗法的有效靶点。这项研究为ASFV NP419L的新功能提供了重要见解，并阐明了其在病毒生物学中的作用。
部分摘要
细胞和病毒
我们实验室保存的HEK-293T和IPI-2I细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的高葡萄糖DMEM培养基中培养。这些细胞在含有5% CO?的空气中于37°C下孵育。由中国农业大学提供的WSL-R4细胞在添加了相同补充剂的RPMI-1640培养基中培养。原代肺泡巨噬细胞（PAMs）从仔猪的支气管肺泡灌洗液中分离并培养。初步筛选和鉴定抑制宿主细胞表达的ASFV基因
ASFV编码了许多蛋白质，其中一些已知可以调节宿主细胞的翻译机制。然而，还有其他调节机制尚未被探索。因此，基于我们实验室之前的实验结果（Shen等人，2021年），我们重新筛选了抑制宿主翻译的ASFV病毒蛋白。根据实验室之前的工作基础，我们选择了荧光素酶活性低于30%的基因（排除了多基因家族中的基因）。讨论
作为细胞内寄生病原体，病毒通常依赖宿主细胞的蛋白质合成机制。它们发展出了多种策略来操控宿主翻译，以增加自身的蛋白质合成，主要通过调节对宿主蛋白质合成至关重要的关键起始因子的活性来实现。
致谢
作者感谢中国农业大学的韩军提供野猪细胞系。本研究得到了中国国家重点研发计划（2021YFD1800104）、国家自然科学基金（32125037）、国家重点研发计划（2025YFD1800600）和湖北省自然科学基金（编号2022CFA027）的支持。
作者贡献声明
郭一琳：软件、方法学、数据管理。王雪莹：撰写——初稿、方法学、研究、数据管理、概念构建。王子轩：监督、软件、数据管理。彭桂清：撰写——审稿与编辑、资源获取、资金筹集。程琳：验证、概念构建。Hakimeh Baghaei Daemi：可视化、监督。牛赛：验证、项目管理。梁瑞：软件、方法学。
