PCBP1通过调控i-motif结构动态调控细胞G1/S转换及基因组稳定性机制研究

《Nature Communications》：Mechanistic insights into PCBP1-driven unfolding of selected i-motif DNA at G1/S checkpoint

本研究揭示了PCBP1蛋白在细胞周期G1/S转换过程中选择性识别并解旋i-motif结构的新型机制。通过多维度实验验证了PCBP1通过其KH结构域协同作用，特异性调控cMYC、BCL2等基因启动子区i-motif的稳定性，进而影响DNA复制及基因组完整性。该发现为理解非经典DNA结构在细胞周期调控中的作用提供了关键理论依据。

在人类基因组中，富含胞嘧啶的区域可形成一种特殊的四链DNA结构——i-motif。这种结构由两条平行双链通过半质子化的C:CH⁺碱基对反向穿插而成，其稳定性高度依赖酸性环境。尽管早期研究认为i-motif仅在非生理条件下存在，但近年来通过iMab抗体等技术，科学家们证实i-motif在细胞核内确实存在，并在转录调控、DNA复制等过程中发挥重要作用。尤其值得注意的是，i-motif常位于原癌基因（如cMYC、BCL2）的启动子区，与互补链上的G-四链体（G-quadruplex, G4）结构形成动态平衡，共同调控基因表达。然而，细胞内i-motif的形成和解析机制，特别是哪些蛋白质参与调控这一过程，仍待深入探索。

为了解决这一科学问题，研究人员聚焦于PCBP1（Poly(rC)-binding protein 1）蛋白。PCBP1属于核内不均一核糖核蛋白（hnRNP）家族，已知可结合富含胞嘧啶的序列，但其在i-motif调控中的具体功能尚不明确。本研究通过整合生物化学、生物物理学及细胞生物学方法，系统阐述了PCBP1如何特异性识别并解旋i-motif，从而确保细胞周期G₁/S转换的顺利进行。相关成果发表于《Nature Communications》。

在研究过程中，团队运用了多种关键技术方法：通过染色质免疫沉淀（ChIP）技术在全基因组范围内鉴定PCBP1与i-motif的结合位点；利用圆二色谱（CD）和核磁共振（NMR）分析i-motif的结构动态变化；采用显微尺度热泳（MST）和等温滴定量热法（ITC）定量测定PCBP1与i-motif的亲和力；建立i-motif去稳定化捕获实验评估解旋动力学；并借助分子动力学（MD）模拟从原子层面揭示KH结构域的解旋机制。所有细胞实验均以HeLa细胞为模型，部分实验还通过双胸苷阻断法实现细胞周期同步化。

PCBP1特异性结合并解旋i-motif

研究发现PCBP1在基因组中显著富集于潜在形成i-motif的C-rich区域，如cMYC、BCL2等基因启动子。体外实验表明，PCBP1对折叠状态的i-motif亲和力（K_D,app≈ 150-300 nM）显著高于其展开形式，且这一过程依赖pH环境。进一步通过缺失突变验证发现，PCBP1的三个KH结构域（KH1、KH2、KH3）需协同作用才能有效解旋i-motif：KH1+2结构域负责初始结合和结构重塑，为KH3的介入提供条件，最终完成解旋。

PCBP1解旋效率受i-motif结构特性调控

不同i-motif序列对PCBP1的解旋敏感性存在差异。例如，cMYC-i-motif易被PCBP1快速解旋，而BCL2-i-motif因自身稳定性高且易形成发夹结构，抵抗解旋的能力较强。当通过点突变破坏BCL2-i-motif的发夹形成倾向后，PCBP1的解旋效率显著提升，说明i-motif的局部二级结构直接影响PCBP1的功能。

PCBP1通过调控i-motif影响细胞G₁/S转换

在细胞层面，PCBP1敲低（knockdown）导致G₁/S期阻滞，并伴随γH2AX水平升高，表明DNA损伤积累。同步化实验显示，PCBP1在G₁/S期特异性结合i-motif位点，促进其解旋以利于DNA复制起始。若PCBP1功能缺失，i-motif结构滞留将阻碍复制进程，引发基因组不稳定性。

讨论与展望

本研究首次揭示了PCBP1作为i-motif解旋蛋白的关键功能，并阐明其通过KH结构域协同作用实现特异性识别和解旋的分子机制。这些发现不仅将i-motif动态与细胞周期调控直接联系，还为理解PCBP1在癌症发生中的作用提供了新视角（例如PCBP1表达异常常见于多种肿瘤）。未来研究可进一步探索PCBP1与其它i-motif结合蛋白（如hnRNP K、hnRNP LL）的协作网络，以及i-motif/G4结构转换在转录-复制冲突中的生物学意义。