《npj Biomedical Innovations》：Engineering scalable vascularized kidney organoids for in vivo glomerular filtration with human endothelial integration
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本文介绍了一种利用搅拌式生物反应器（STR）大规模生产血管化肾脏类器官的创新方法，成功将生产效率提升50倍以上，并显著增强了肾小球血管化和肾小管成熟度。该研究通过整合机械传感整合素α2β1信号，实现了人源内皮细胞整合的功能性肾单位构建，并在小鼠体内模型中证实了其具有尺寸选择性的滤过功能。这项工作为肾脏疾病建模、药物筛选乃至未来生物人工肾的研发奠定了重要基础。
慢性肾脏病（CKD）和终末期肾病（ESKD）患者数量持续上升，对创新性肾脏替代疗法提出了迫切需求。人多能干细胞（hPSC）来源的肾脏类器官为研究肾脏发育、疾病建模和药物开发提供了崭新平台，并有望推动肾脏再生医学的进展。然而，传统的静态培养方法存在生产效率低、成本高、劳动密集型等局限性，难以实现大规模生产，尤其无法生成具有功能性肾小球血管化的类器官，这严重阻碍了其向临床应用和工业化生产的转化。此外，现有类器官缺乏与宿主循环系统有效整合的能力，限制了其在体内模拟肾脏滤过功能的应用。
为了应对这些挑战，研究人员在《npj Biomedical Innovations》上发表了题为“Engineering scalable vascularized kidney organoids for in vivo glomerular filtration with human endothelial integration”的研究。该研究开发了一种基于搅拌式生物反应器（Stirred-Tank Bioreactor, STR）的新型培养系统，旨在实现血管化肾脏类器官的成本效益高、可扩展的大规模生产，并评估其体内功能。
本研究主要采用了以下关键技术方法：利用搅拌式生物oreactor（STR）进行hPSCs的定向分化和类器官的规模化扩增；通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和批量RNA测序（RNA-seq）进行转录组学分析；利用共聚焦显微镜、组织透明化和三维（3D）图像重建（如IMARIS软件）进行详细的形态学评估；通过活细胞成像（如Rhodamine 123转运实验）和 multiphoton intravital microscopy (MP-IVM) 评估类器官功能（如阳离子转运和滤过功能）；使用整合素α2β1抑制剂BTT3033进行功能扰动实验；并将预血管化的肾单位薄片植入免疫缺陷小鼠（NSG）的背侧皮肤褶皱腔（DSFC）中进行体内功能验证。研究所用细胞系包括H9人胚胎干细胞（ES细胞）、BJFF.6人诱导多能干细胞（iPS细胞）和HUES62人ES细胞。
Results
3D culture using stirred bioreactors enables the cost-efficient mass production of kidney organoids
研究人员开发了一种在单一STR中使用明确材料进行大规模生产的方案。通过优化搅拌速率、细胞接种密度和球体形成持续时间等参数，他们发现80 rpm的搅拌速率和100–200 μm直径的球体是启动分化的最佳条件。与静态培养相比，STR系统将培养培养基中的细胞密度提高了51倍（8.19 × 106cells/ml vs 1.59 × 105cells/ml），成本降低了88%，总细胞产量提高了13.1倍，所需劳动力减少了74%。STR系统成功地将H9和BJFF.6 hPSCs高效分化为表达SIX2和SALL1的肾单位祖细胞（NPCs），并进一步形成包含足细胞（PODXL+）、近端小管（LTL+）、髓袢/远端小管（CDH1+）、基质细胞（MEIS1/2/3+ PDGFRβ+）和内皮细胞（CD31+）的肾脏类器官。
Long-term culture of STR organoids
通过基于机器学习（LABKIT）的3D成像分析，研究发现STR类器官在长期培养（至第49天）中保持稳定，足细胞簇（PODXL+）数量约为30个，且基质细胞（PDGFRβ+）体积略有增加但整体维持稳定。有趣的是，血管结构在长期培养中大量发育。透射电子显微镜（TEM）分析显示，第35天和第70天的STR类器官中的肾小管上皮细胞具有丰富的细胞器（如内质网、高尔基体和线粒体）和刷状缘样结构，表明其代谢活跃且健康，无组织退化迹象。
Transcriptomic evaluation by RNA-seq in static and STR organoids
RNA-seq分析显示，STR类器官和静态类器官的基因表达谱均随时间发生变化，但STR类器官的纵向成熟过程似乎更快。主成分分析（PCA）和层次聚类表明，第21天的STR类器官与第21/35天的静态类器官相似，而第35/49天的STR类器官则与第49/63天的静态类器官更接近。差异表达基因（DEG）和基因本体（GO）分析发现，STR类器官中与转运体活性（如有机阴离子转运、阳离子转运）、肾脏发育、血管系统发育等相关的基因显著上调。
Glomerular vascular development is enhanced in STR organoids
肾小球血管化对于肾脏的滤过功能至关重要。研究发现，STR培养环境通过机械感应整合素（特别是α2β1）显著增强了类器官肾小球的血管化。全标本免疫染色和3D重建图像显示，STR类器官的肾小球内形成了CD146+的人源内皮细胞网络，并被MEIS1/2/3+的基质样细胞（推测为系膜细胞）和极化的足细胞（PODXL+）所包围。而静态培养的类器官则缺乏这种内部的肾小球血管化。使用整合素α2β1抑制剂BTT3033处理后，STR类器官的肾小球血管化被显著抑制，这证实了整合素信号在机械应力诱导的肾小球血管形成中的关键作用。
Single-cell RNA sequencing in STR organoids and their static counterparts
单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析进一步揭示了STR培养的分子特征。与静态类器官相比，STR类器官的内皮细胞、足细胞和间质细胞簇中，与血管发育、血管生成、细胞外基质组织、细胞骨架重组（如肌动蛋白细胞骨架组织）等相关的生物学过程显著富集。此外，STR类器官的近端小管（PT）和髓袢/远端小管（LoH/Distal）簇中，与阳离子和钙离子结合、通道活性相关的基因表达也上调，这与功能实验中观察到的增强的Rhodamine 123（Rh123）阳离子转运结果一致。
Prevascularized nephron sheets perform filtration function when implanted into NSG mice through the anastomosis between the human endothelial network and host murine vasculature
为了评估类器官的体内功能，研究人员将STR培养产生的肾单位薄片植入NSG小鼠的背侧皮肤褶皱腔（DSFC）中。 Multiphoton intravital microscopy (MP-IVM) 显示，植入的肾单位薄片中的肾小球样结构能够选择性滤过低分子量（LMW, 3 kDa）的右旋糖酐（dextran），而高分子量（HMW, 500 kDa）的右旋糖酐则被限制在血管腔内。免疫组织化学分析证实，植入薄片中的人源（CD146+ MECA-32-）内皮网络与宿主的鼠源（MECA-32+）血管系统形成了吻合，从而支持了功能性滤过的发生。
结论与讨论
本研究成功建立了一种利用搅拌式生物反应器（STR）大规模生产血管化肾脏类器官的高效、经济的方法。该系统不仅显著提高了类器官的产量并降低了成本，更重要的是，它通过机械应力诱导的整合素α2β1信号通路，促进了类器官肾小球内人源内皮细胞的整合和血管化，这是静态培养无法实现的。转录组学和功能实验（如Rh123转运和体内滤过实验）均证实STR类器官在肾小管成熟和肾小球滤过功能方面更具优势。
将这种预血管化的肾单位薄片植入小鼠体内后，其成功实现了与宿主血管系统的吻合，并表现出尺寸选择性的滤过功能，证明了其潜在的应用价值。这项研究在连接基础研究与商业化产品之间迈出了重要一步，为未来开发用于肾脏替代疗法的生物工程肾脏奠定了基础。然而，研究也指出当前类器官仍缺乏集合管系统，无法形成尿液引流通路，且肾小球毛细血管袢的形成程度仍低于天然肾脏，未来的研究需要进一步优化培养条件，并解决与宿主组织整合和功能成熟相关的挑战。总之，这项工作为肾脏疾病建模、药物毒性测试乃至最终的器官移植提供了一种有前景的可扩展平台。
