《npj Biomedical Innovations》：From organoid culture to manufacturing: technologies for reproducible and scalable organoid production
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本综述系统性地将多种类器官工程策略（包括细胞编程、材料工程和平台/系统级创新）按其对可重复性和可扩展性的影响进行分类，并重点介绍了代表性应用和新兴方向。通过将类器官生成重新定义为制造过程，这些技术进步为面向基础研究和转化应用的标准化的高保真类器官生产铺平了道路。
类器官是由干细胞衍生的三维（3D）、自组织多细胞结构，能够复现人类器官的关键结构和功能特征。在过去的十年中，针对多种器官系统和病理背景已建立了稳健的方案，使得生成用于研究人类发育、疾病机制和治疗反应的生理相关模型成为可能。类器官技术正从一种新兴的实验室方法向具有 imminent 临床和商业影响的工业规模技术转变。
然而，类器官生产在可重复性和可扩展性方面持续存在的挑战，已成为其在研究、临床和工业领域更广泛应用的主要障碍。传统的类器官培养通常在受控程度最低的环境条件下，通过自发的自组织进行。这种自下而上的方法虽然重现了自然器官发生的关键方面，但由于基质组成和空间组织等培养条件控制不佳，常常导致类器官结构的批次间显著差异。此外，传统的类器官培养过程通常使用低通量平台并依赖人工操作，生产效率低下。这些问题削弱了高通量应用中的检测保真度，并可能产生不一致的生物学反应，使药效和安全性评估复杂化。
提高可重复性的工程策略
可重复性仍然是类器官技术更广泛应用的关键障碍，这主要源于培养过程中生物和环境维度上的不受控变异。提高可重复性的工程策略主要围绕减少基质变异性和控制空间形态发生两个方面。
在减少基质变异性方面，传统的动物组织来源的细胞外基质（ECM），如Matrigel和Geltrex，存在批次间变异大、分子组成不明确、机械特性控制不佳等问题。为了解决这些问题，合成的、化学成分明确的水凝胶，如聚乙二醇（PEG）、聚异氰酸酯（PIC）、聚丙烯酰胺（PAAm）和聚乙烯醇（PVA）水凝胶，受到了广泛关注。这些合成水凝胶具有可精确控制的化学和机械特性，批次间变异性极小，并允许以可控的方式掺入ECM组分或粘附配体（如RGD肽、层粘连蛋白片段等）。例如，在肠道类器官培养中，工程化的PEG水凝胶能够精确控制基质组成、力学和生化信号。研究发现，基于纤连蛋白的粘附和较高的基质刚度（约1.3 kPa）通过YAP依赖性机制促进肠道干细胞扩增，而具有层粘连蛋白粘附的软基质（软化后约190 Pa）则支持肠道干细胞分化和类器官形态发生。利用这种可控性，设计了机械动态的PEG水凝胶，使其能够从优化扩增的状态（约1.3 kPa）转变为允许分化的状态（约190 Pa），从而可重复地生成小鼠和人的肠道类器官。
在控制空间形态发生方面，一系列工程策略被开发出来，通过最小化培养环境中不受控的变异以及调节内在的形态发生过程来引导类器官形态发生。这些策略主要包括外部边界限制和内部支架引导的组织。外部边界限制通过物理边界定义类器官的大小和形状，例如微孔阵列平台可以将细胞分割成数百到数千个微区室，进行并行化的均匀细胞聚集体形成。例如，一个包含微孔的6孔板可产生多达1000个肾脏类器官，远超过常规格式的产量。此外，微孔阵列的固定空间排列便于空间索引和长期监测。内部支架引导的组织则通过引入支撑结构来指导组织方向和空间 patterning。例如，微纤维基支架可以引导早期类器官的几何形状，促进大脑类器官中大型端脑囊泡的可重复出现。可光图案化的基质力学调节能够局部控制机械线索，引导对称性破缺、出芽和上皮折叠等关键形态发生过程。
提高可扩展性的工程策略
类器官的应用通常需要生产大量类器官。例如，高通量药物筛选可能需要数百至数万个类器官，以便在多种化合物和剂量范围内进行统计学上稳健的比较。而在组织工程和再生医学中，所需的规模更大。传统的ECM基质培养仅支持单位面积有限数量的类器官，从而限制了生产力。
为了提高类器官前体（如胚状体或祖细胞团）的生产力，工程策略主要分为三类：通过将细胞分割成众多微区室进行并行化形成来提高单位面积的前体密度；通过自动化工作流程实现连续的前体生产以维持高通量输出；通过扩大培养体积以批量维持和扩增前体。代表性的培养平台包括用于高密度形成的微孔阵列平台、用于连续生产的基于液滴的微流体系统以及用于大体积扩增的悬浮生物反应器。
微孔阵列平台通过将数百至数千个微孔集成到一个孔中，显著提高了单位面积的类器官产量，且操作简单。例如，UniMat（一种可渗透的纳米纤维膜基微孔阵列）能够以约每平方毫米5个类器官的密度可扩展地生产均匀的肾脏类器官。液滴微流体系统通过将细胞包裹在数千个单分散的水滴中，实现连续、高通量的类器官前体生产，通常速率可达每秒一个类器官。悬浮生物反应器（如搅拌瓶、旋转壁容器和搅拌罐生物反应器）通过动态混合环境维持聚集体的悬浮状态，实现大体积扩增，工作体积可从数百毫升到数升，显著提高了总类器官产量。
随着类器官生产规模扩大到每批生产数千个，相关的流程操作（如培养基更换、监测和处理）也必须相应扩大规模，否则会成为瓶颈。自动化策略针对大规模工作流的两个关键方面：自动化类器官培养和自动化类器官处理。自动化类器官培养平台可以执行常规维护任务，如细胞接种、培养基更换、环境控制和实时监测。自动化类器官处理技术则实现了对单个类器官的精确、可重复和高通量操作，例如Pick-and-Place（拾取-放置）方法、Drop-on-Demand（按需滴落）方法、磁引导以及Pick-Flow-Drop（拾取-流动-滴落）混合方法等，减少了操作人员的工作量，提高了整体流程效率。
由可重复和可扩展生产加速的应用
提高可重复性和可扩展性的工程进步正在帮助克服类器官技术的内在局限性，从而实现更精确、高通量的药物测试，并推动再生医学应用。
在转化医学方面，微孔阵列通过产生大批量高度均匀的类器官，加速了精准转化应用。例如，使用微孔阵列生产的人皮质类器官具有一致的尺寸和形态，支持对超过2400个类器官进行约300种FDA批准化合物的标准化神经毒性测试。患者来源的肺癌类器官在微孔阵列上在一周内生成，可获得与患者来源异种移植模型、肿瘤突变谱和临床结果一致的临床有意义的药物反应谱，显示了个性化肿瘤学的潜力。
在再生医学方面，虽然直接整合工程技术进行可重复或可扩展类器官生产的例子仍然有限，但许多概念验证研究已表明类器官在组织修复和功能恢复方面具有巨大潜力。完全化学成分明确的、可机械调节的PEG水凝胶平台能够从患者活检组织中可重复地生成肝脏类器官，表现出关键的肝脏功能。可牺牲的水凝胶基微孔阵列可以生成数万个血管化类器官，并将其组装成宏观组织构造（约1厘米）用于植入，促进了小鼠体内快速的血管化。搅拌罐生物反应器用于生产临床相关规模的iPSC聚集体，为患者特异性的再生疗法铺平了道路。
结论与未来展望
类器官技术已从实验性实验室模型发展成为在药物发现、疾病建模和再生医学中具有巨大潜力的平台。最近的工程技术进步开始将类器官培养重新定义为可控的制造过程，而不是纯粹的生物学现象。明确的合成水凝胶解决了基质相关的变异性问题。限制形态发生的空间调控方法也提高了均匀性。同时，高通量生产平台显著提高了产量，而自动化培养和处理系统减少了人工操作，提高了流程一致性。
然而，大多数这些技术是孤立开发的，通常针对特定的类器官类型、生产阶段或实验目标进行优化，而不是作为集成制造流程的组成部分。因此，虽然每种方法单独改善了可重复性或可扩展性的某些方面，但缺乏互操作性限制了它们在向工业或临床部署时的整体影响。将不同的工程创新（合成水凝胶、空间调控策略、高通量平台/系统、自动化系统）在细胞制备、类器官前体生产、分化、培养和操作相应阶段内整合起来，可以弥合这些差距。
此外，人工智能（AI）技术正越来越多地融入类器官研究，主要用于分析任务，如高通量基于图像的表型分析、自动形态学分类和多组学数据集整合。将AI扩展到生产过程中可以显著提高可重复性和可扩展性。例如，AI驱动的图像分析流程可以嵌入培养系统，提供分化过程的实时监测，实现连续的细胞质量控制和早期偏差检测。结合自动化培养平台，此类算法可以响应连续成像或生物传感器反馈，动态调整喂养方案、生化梯度或机械线索，创建自适应、自校正的制造管道。
随着生物制造、生物材料设计和血管化策略的不断发展，这些类器官系统可以进一步适应为可植入的构造，为功能性组织替代可行、安全且个性化的再生医学应用开辟道路。
